濱海鹽堿地根際溶磷細菌磷素轉化特征

劉 萍, 夏江寶

1 濱州學院生物與環境工程學院, 濱州 256600 2 山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室, 濱州 256600

黃河三角洲鹽堿地土地資源豐富,而土壤養分轉化是鹽堿地植被生長及其生產力的主要限制因素之一[1],其中,磷素是植物生長發育所需的主要養分之一[2- 4],主要存在于植物的核酸及細胞膜磷脂等,并通過植物的一系列生理活動促進作物生長[5]。植物中的磷主要從土壤中獲取,其含量約為干重的0.2%。據研究,鹽堿地磷庫源相對豐富,但是可用于生物合成的磷不僅僅取決于土壤中磷庫總量,還取決于其溶解度,而溶解度又取決于土壤中磷的化學反應和生物相互作用[6- 7]。由于鹽漬土壤含有較多的堿性物質,致使部分磷素庫源不能被植物直接吸收利用,而是被固化形成難溶性的磷酸鈣鹽；同時,土壤中的金屬離子,包括Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等物質,同樣可與磷元素形成難溶性磷酸鹽,這部分不能被植物體直接吸收的磷庫源,稱為無效態磷[8]。因此,如何將無效態磷轉化為有效態磷,提高土壤有效磷含量,這一問題越來越受到國內外諸多科研工作者的關注,也是本研究的主要目的。

探明鹽堿地生境中土壤肥力的提升途徑與機制,尤其是有效磷含量的提高途徑,對提高鹽堿地土地利用及植被種類和生物量,具有較大意義[9]。植物根際微生物種類和數量較豐富,與植物共存形成了根際圈微生物群落,對植物的生長、抗病性及生物產量提高等多方面具有積極的意義[10- 13]。其中溶磷微生物 (phosphate solubilizing microorganisms,PSM)是土壤微生物的主要類群之一,同時也是根際微生物的重要組成部分[14],能將難溶性的磷酸鹽如礦磷粉轉化成為植物可吸收利用的磷素,對提高土壤有效磷含量、緩解植物鹽堿脅迫損傷及改良鹽堿土具有積極作用[8]。

本實驗對黃河三角洲濱海鹽堿地典型鹽生植物堿蓬根際土壤溶磷微生物進行了研究。采用改良的PKO培養基,共篩選出17株溶磷菌。通過復篩,得到一株溶磷效果較好的耐鹽堿溶磷細菌,對其溶磷能力進行了研究,希望能為改良鹽堿地、提升土壤肥力提供一點理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗菌株

從黃河三角洲鹽地堿蓬根際土壤中篩選了一株溶磷細菌,其編號為RPB03。菌落粘稠,中間隆起,邊緣光滑,呈淡黃色,革蘭氏染色陰性。

1.1.2培養基

溶磷微生物初次分離采用改良的PKO培養基[15- 16],液體菌種培養采用牛肉膏蛋白胨液體培養基,溶磷能力研究以PKO培養基為基礎培養基。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl5.0 g、水1000 mL,用NaOH調pH7.4—7.6。

改良PKO培養基：葡萄糖10.0 g、Ca3(PO4)25.0 g、(NH4)2SO40.50 g、NaCl 0.20 g、KCl 0.20 g、MgSO40.03 g、MnSO40.03 g、FeSO40.03 g、蒸餾水1000 mL。pH8.0—8.2。

1.1.3儀器和試劑

恒溫搖床,超凈工作臺,光照培養箱,紫外分光光度計,GTR10- 1型高速冷凍離心機。試驗試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1土樣采集及溶磷微生物分離與純化

采集黃河三角洲鹽地堿蓬根際土壤置入無菌袋內,帶回實驗室。采用涂布平板法進行微生物分離培養,純化后,接種于PKO培養基培養12 d,觀察平板,記錄菌落直徑及溶磷圈直徑,并計算溶磷系數。

溶磷系數=H/C(H表示溶磷圈直徑,C表示菌落直徑)。

1.2.2溶磷動力學曲線測定

將RPB03菌株活化后,接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基平板中培養24h。用無菌接種環取一環接入200 mL PKO液體培養基中混勻,置于30℃搖床培養。分別在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d及6 d吸取培養液,用鉬銻比色法測定溶液中有效磷含量[17],用分光光度法在600nm下測定菌體細胞吸光度值。

1.2.3培養條件

將保存的菌種RPB03活化,液體培養36 h,離心取菌體,洗滌后用PKO液體培養基活化,取1 mL(含菌量為108菌落數/mL)的種子液轉接入PKO培養基,按照下列條件進行搖床培養。培養48h后,10000 rpm/min離心15 min,濾液過0.22 μm微孔濾膜后,測定有效磷含量。

pH值設置6、7、8、9 和 10；溫度設置10℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃；轉速設置為50、90、130、170和210 rpm/min；鹽濃度設置分別為0%、1%、2.5%、5%、7.5%和 10%；碳源分別用麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和葡萄糖作碳源；氮源分別為硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素、氯化銨。碳源和氮源添加量分別是10 g和0.5 g。

1.2.4菌株RPB03對鹽漬土壤磷素轉化效果

供試土壤類型為鹽堿化潮土母質土壤,土壤理化性狀：全磷0.530 g/kg、全鉀0.943 g/kg、堿解氮0.086 g/kg、速效磷0.029 g/kg,pH 8.0,含鹽量0.34%。

(1)對裸斑鹽漬土壤磷素轉化效果

取兩份等量的黃河三角洲鹽堿土,分為控制組和實驗組,控制組土壤采用干熱滅菌法進行土壤滅菌,用烘箱170℃烘干2 h,實驗組土壤不做任何處理。兩份土壤分別置于經無菌處理的花盆內,將培養36 h的RPB03細菌細胞施入花盆,在處理第0天、30天、60天 取土樣測定土壤中有效磷含量。

(2)對有植被鹽漬土壤磷素轉化效果

將鹽堿土混合少量氮鉀肥,分裝花盆。處理組施加RPB03菌劑,對照組(CK)添加等量水。處理120 d后,測試中華結縷草(ZoysiasinicaHance)生物量以及土壤中有效磷含量。

1.2.5菌株鑒定

將純化的細菌菌株斜面提交上海生物工程有限公司,由其進行16SrRNA序列測定,將獲得的序列輸入GenBank,用Blast 程序與數據庫中的序列進行比較分析,利用 MEGA7 軟件進行系統發育樹的構建。

1.2.6統計分析

采用SPSS13.0進行數據處理,組內數據比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鹽地堿蓬根際解磷微生物解析

2.1.1鹽地堿蓬根際土壤中溶磷微生物種類

從鹽地堿蓬根際土壤中共分離17株溶磷菌,其中真菌2株,放線菌2株,細菌13株,其溶磷效果見表1。依據溶磷菌對磷酸鈣的溶解能力,發現RPB03在生長繁殖及溶磷能力方面,效果比較優良,故對其進行了進一步研究。

表1 堿蓬根際溶磷微生物

2.1.2菌株RPB03溶磷動力學

為了更準確地測試RPB03菌株的溶磷能力,對該菌株進行了動力學研究(圖1)。隨培養時間延長,培養液中可溶性磷含量呈現先升高后降低再升高的趨勢,而菌體細胞量基本呈現持續升高的趨勢。在測試0—2d內,菌體的生長與溶液中可溶性磷含量趨勢保持一致,皆呈現上升趨勢,在培養第2天有效磷含量達到最大,為318.45 mg/L；在此之后至第4天,隨著菌體細胞呈現持續生長趨勢,其可溶性磷含量持續下降,至第5天時降至最低,為60.11 mg/L；與此同時,菌體的生長也有所減緩；第6天可溶性磷含量有所提高,而菌體細胞生長量也達到最大量。根據動力學曲線,可將該菌的溶磷能力測試時間設置為48h。在0—48h之間,其磷素轉化能力與微生物細胞生物量之間相關性很大,其相關系數R值為0.9486。但隨著RPB03菌株生物量的增大,其溶液磷含量與菌體量之間卻呈現出負相關性,可見隨著微生物生物量的增加,細胞對溶液中可溶性磷的溶解作用大于吸收作用,隨著微生物菌體數量的不斷增加,對磷素的需求急速提升,從而造成后期溶液磷素含量的下降。

圖1 RPB03菌株溶磷動力學曲線Fig.1 The dissolved phophorus kinetic curve of strain RPB03不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理時間內溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2 密閉培養條件下,不同環境因子對RPB03菌株溶磷能力的影響

2.2.1不同酸堿度對RPB03菌株磷素轉化效果

隨溶液初始pH值的升高,RPB03菌株溶磷能力不斷下降,當pH>8條件下溶磷效果存在顯著差異(圖2)。pH6—8范圍內其溶磷能力無差異,皆超過430 mg/L,初始pH6時RPB03溶磷效果最好,達到450.57 mg/L。當pH提高到9時,其溶磷能力有所降低,下降至385.19 mg/L,當pH提高至10時,仍然具有一定的溶磷能力(175.13 mg/L)?？梢?該菌株從微酸性至堿性的范圍內皆有溶磷能力,并且在較強的堿性環境條件下,仍然可以通過調節環境酸堿度進行磷的轉化。黃河三角洲土壤呈弱堿性[1- 2],pH值在8左右,從實驗數據推測,該菌能夠很好的適應該地區的土壤堿度。

圖2 不同pH值對RPB03菌株溶磷能力的影響 Fig.2 Effect on the soluble phosphorus ability of RPB03 strain under different pH value不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

培養48h后,各處理溶液pH值皆低于7,甚至有處理組(pH=8)低至4.21。溶磷能力與終點pH值相關系數R值為-0.9508。

2.2.2不同溫度條件下對RPB03菌株磷素轉化影響

溫度是影響微生物生長繁殖及新陳代謝的一個重要因子。不同溫度條件下RPB03溶磷效果存在顯著差異(圖3),溫度為35℃時,有效磷含量達到最高,為446.70 mg/L,其次是30℃。溫度降低至10℃時,有效磷含量僅為52.57 mg/L,可能是低溫限制了細菌正常的生長繁殖,導致溶磷效果較差；當溫度高達45℃時,其具有相對較高的溶磷能力(有效磷含量為119.52 mg/L)。野外地面溫度一般不超過45℃,推測該菌施入土壤后,能夠適應其溫度的變化范圍。培養48h后,各處理溶液pH值與溶磷能力之間仍然存在顯著的負相關性,相關系數R值為-0.9718。

圖3 不同溫度對RPB03溶磷能力的影響 Fig.3 Effect of PRB03 strain on the soluble phosphorus ability at different temprature 不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2.3不同轉速對RPB03菌株磷素轉化效果

不同的轉速條件下,培養液中的溶氧量不同,轉速越高,培養液中溶氧量越高。隨著搖床轉速的提高,RPB03菌株溶磷能力有所提高(圖4),當轉速高于170 rpm/min時,其培養液中有效磷含量明顯高于較低轉速的含量?？傮w來看,具有較低終點pH值的處理組其有效磷含量也相對較高,但其溶磷能力與終點pH值相關性較差,其相關系數R值為-0.2640,如50 rpm/min處理組,其終點pH值為5.2,低于170 rpm/min處理組,但其磷素轉化能力僅為168.93 mg/L。推測RPB03菌株在較低的溶解氧條件下,菌細胞生長緩慢,也可能由于氧含量較低導致細菌代謝方面發生了變化,進而影響其酸溶磷素的能力。很多研究結果表明,溶磷菌溶磷能力與產酸能力并不呈現顯著的相關性,與本實驗結果一致的。

圖4 不同轉速對RPB03菌株溶磷能力的影響 Fig.4 Effect of PRB03 strain on the soluble phosphorus ability at different rotational speed不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2.4不同鹽度對RPB03菌株磷素轉化效果

不同NaCl鹽度條件下,RPB03菌株溶磷能力存在顯著差異(圖5)。隨鹽度增加,溶磷能力呈下降趨勢,但在5%鹽度下,RPB03菌株溶磷能力呈現一個跳躍的高峰,與無鹽條件下磷素轉化能力相比較,兩者未達到差異顯著水平。為什么在鹽度5%條件下再次出現峰值呢？筆者認為,微生物對鹽度的耐受能力可能存在一個敏感范圍,5%的鹽度范圍可能正好是處于該菌的鹽度敏感區間,在敏感鹽度范圍內,有可能激活微生物某些基因的表達來適應環境。但具體原因究竟如何,還需要進一步的研究。終點pH值結果顯示,這兩個處理組終點pH值也較低。溶磷能力與終點pH值相關分析呈現顯著負相關,其相關系數R為 0.8890,推測該菌溶磷能力可能與細菌釋放的酸性物質有關。

圖5 不同NaCl濃度度對菌株RPB03溶磷能力的影響 Fig.5 The effect of RPB03 strain on soluble phosphorus ability under different NaCl concentration不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.2.5不同碳源及氮源對RPB03菌株磷素轉化效果

碳源和氮源是微生物生長所需的兩種必需元素。碳源及氮源的種類及比例不同,不僅影響到微生物細胞的生長與繁殖,對其代謝產物也會產生很大的影響。

RPB03菌株對所試的五種碳源的利用能力不同,其溶磷效果存在顯著差異(圖6)。葡萄糖作唯一碳源時溶磷效果最好,達到500.87 mg/L,其次是蔗糖,乳糖作唯一碳源時效果最差。不同碳源溶磷能力與終點pH相關性不是太大,以乳糖作唯一碳源時,其終點pH值比可溶性淀粉要低,但是其溶磷能力僅為其可溶性淀粉的79.24%,呈現顯著差異。而溶磷效果最好的終點pH值6.82,呈微酸性,明顯高于乳糖為碳源的pH值(5.16)?？梢?RPB03菌株在利用不同碳源時,溶磷效果、代謝途徑會發生變化,導致其溶磷能力出現差異,而酸溶磷可能不是RPB03菌株降解礦物質磷素的唯一途徑。溶磷能力與終點pH值相關系數R值為0.5308。

圖6 不同碳源條件下RPB03菌株溶磷能力 Fig.6 Soluble phosphorus ability of RPB03 strain at different carbon source 不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

利用不同氮源時RPB03菌株溶磷效果亦存在顯著差異(圖7)。其溶磷效果為KNO3>NH4NO3>(NH4)2SO4>NH4CI>urea。從氮源形態來看,硝態氮優于銨態氮,尿素效果最差。溶磷能力與終點pH值相關性不高,其相關系數R值為-0.6287。

圖7 不同氮源下RPB03菌株的溶磷能力 Fig.7 Soluble phosphorus ability of RPB03 strain at different nitrogen source不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理組間差異顯著(P<0.05)

2.3 RPB03菌株對黃河三角洲鹽堿土壤磷素轉化效果

2.3.1RPB03菌株對裸斑鹽漬土壤的溶磷效果

為了研究該菌株對裸斑鹽堿地土壤的磷素轉化效果,設置了滅菌土壤和非滅菌土壤兩個處理實驗。從實驗結果來看,投加RPB03菌劑后,有效磷含量明顯提高,磷素轉化效果顯著(圖8)。滅菌土壤處理組和未滅菌處理組有效磷含量由最初0.029 mg/kg分別提升至0.041 mg/kg和0.043 mg/kg。從實驗結果我們還發現,黃河三角洲鹽漬土壤中的其他微生物類群與RPB03菌株具有潛在的協同效應,但協同效果不顯著。

圖8 RPB03菌株對無植被土壤的溶磷效果 Fig.8 The effect of PRB03 strain on the phosphorus solubliziton in soil without vegetation不同小寫字母表示溶磷菌株在不同處理組間溶磷能力差異顯著(P<0.05)

2.3.2植被存在條件下溶磷菌RPB03對鹽漬土壤的溶磷效果

為了進一步驗證該菌株在植被存在條件下對土壤肥力的提升效果,選取了中華結縷草,進行了盆栽實驗 (表2)。中華結縷草是黃河三角洲地區常見的草坪草種,耐踐踏,適應性強。從表中可以看出,兩個處理組土壤有效磷含量都有所提高,但提高程度不同,施加菌劑處理組顯著高于對照組。雖然對照組沒有投加溶磷細菌,但土壤本身存在溶磷微生物。在植物生長過程中,由于根際分泌代謝物質,土壤溶磷細菌會在根際圈內富集,從而在一定程度上提高了土壤有效磷含量,但其提高程度不如處理組?？梢?該菌在植被存在條件下,同樣能夠有效轉化土壤中的無效磷,提高土壤有效磷含量。

表2 溶磷菌RPB03對中華結縷草株高、干重及土壤磷含量的影響

投加RPB03菌株處理組,不僅能夠提高土壤有效磷含量,也能夠促進中華結縷草的生長。其平均株高可達29.47 cm,與對照組相比差異顯著。宇萬太等[7]在潮棕壤上連續進行18年的定位試驗,發現單使磷肥對玉米秸稈增加并不顯著,與本實驗結果相反。除了實驗材料的差異外,兩者的實驗土壤截然相反。本實驗土壤采自黃河三角洲非耕地鹽漬土壤,土壤貧瘠,有效磷含量極低,這可能是對照組植物生長不良的主要原因之一。而宇萬太等研究者采用的是農田耕地,土壤中有效磷含量本底水平高,且磷庫源充足,磷素對植物生長的影響較小。姜煥煥[7]也發現,解磷菌可提高鹽堿地土壤酶活性與土壤微生物數量,尤其可促進參與土壤營養元素的微生物種類的富集,全面改善鹽堿土性質,促進了植株的生長。

2.4 RPB03菌株的鑒定

經 PCR 擴增后菌株RPB03的16SrRNA序列全長為1397bp,GenBank 登錄號為MH247129,BLAST分析結果顯示該序列與泛菌屬(Pantoeasp.)的16SrRNA序列同源性最高,其中與菌株Pantoeavagans(CP014129)有較高的同源性,相似度均為100%,其他菌株的相似性達到99%(圖9)。綜上,確定菌株 PRB03隸屬泛菌屬。

圖9 RPB03菌株系統發育樹Fig.9 Polymeric analysis of strain RPB03

3 討論

3.1 根際溶磷細菌的溶磷效果及機理

研究表明,土壤溶磷微生物多數通過分泌酸性物質分解土壤中不溶性磷素,也有相當一部分溶磷微生物通過胞外酶來分解環境中的有機磷,例如分泌堿性磷酸酶。Khadija Ayyaz從小麥根際分離到五株具有溶磷特性的固氮螺旋菌(Azospirillumsp.)[18],可向生境中分泌醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸及琥珀酸等有機酸促進磷素的有效轉化。本試驗菌株RPB03在溶磷能力研究過程中,亦發現其溶磷效果與溶液的pH值之間呈負相關,推測該菌株溶磷機理可能通過分泌酸性物質促進了磷酸鈣的降解,但其酸性物質的種類還需要進一步研究。

據報道,溶磷菌不僅能夠有效提高土壤有效磷含量,對植物的生長發育、抗病性等方面皆具有積極的意義[19- 20]。已報道的溶磷菌Bacillusmegaterium[21]、Achromobacterxylosoxidans(JCp4)、Ochrobactrumsp.[22]、Pseudomonassp.[13]等多個屬種的微生物都能夠有效促進植物的生長。其促生機理主要表現在能夠分泌植物生長素IAA(indole acetic acid)。本實驗菌株RPB03在中華結縷草株高、干重等方面都具有促進作用,與對照相比差異顯著,但該菌株是否通過分泌植物生長素促進了植物的生長并未研究。

RPB03菌株分離自堿蓬根際,Blast比對結果顯示隸屬泛菌屬(Pantoea)。已有研究報道該屬對植物生長、抗病性方面具有良好的效果[23- 24]。張麗珍自檸條植物體內分離到一株內生泛菌,與本研究菌株皆為Pantoeavagans[25],但其溶磷能力卻相差甚遠,僅為4.45 mg/L。該菌株在檸條和堿蓬的生存環境完全不同,這可能是兩者解磷能力的差異主要原因。Son[26]、Chung[27]等學者也分別從大豆根際和農作物根際分離到溶磷泛菌,其溶磷能力分別為900 mg/L和113.7 mg/L?？梢姺壕鷮偌毦鷱V泛存在于多種植物根際,是構成根際微生物的主要類群之一。從已有的研究不難發現,不同植物根際分離的泛菌,其溶磷能力差異較大,分析其原因,可能跟泛菌所處的生態環境及植物根系的代謝產物有關。本研究結果也證實了不同的因子、土壤植被情況對RPB03菌株的溶磷能力影響較大。當然,室內實驗條件與自然生境存在很大差異。本研究結果也只是模擬部分因子,采用了單因素實驗,其結果與在自然條件下該菌株的解磷能力相比較,究竟存在何種差異,還需要進一步探討。

3.2 溶磷細菌對土壤肥力提升效果

黃河三角洲是由黃河攜帶大量泥沙在入?？谟俜e而成的新生陸地,受河流和海洋等多種動力交互作用,該地區潛水埋深淺、礦化度高,導致土壤鹽漬化較重、范圍廣,成為限制黃河三角洲土地生產力的主要因素之一[28]。目前,我國對鹽漬土的改良多采用物理及生物手段[29- 30],利用微生物制劑改良鹽堿地的實踐研究仍然相對滯后。在黃河三角洲地區,常采用不同植被模式[28]、灌水降鹽[31]及生物改良劑[32]等措施,其主要目的是降低土壤中的鹽分含量。對于利用解磷微生物提升土壤肥力的研究還相對薄弱,多停留在解磷微生物的一些基礎性研究[9- 10]。姜煥煥自黃河三角洲分離到一株解磷菌Providenciarettgeri[8],利用該菌與磷石膏聯合施用對鹽堿土進行了改良,發現對土壤有效磷提升量增加了19.57 mg/kg。李學平等自濱海鹽堿地某蔬菜根際分離到一株高效解磷真菌,對小麥具有顯著的促生長效果[9]。Singh等對溶磷真菌也進了部分研究,能夠顯著提高小麥和玉米產量[33]。本研究篩選的溶磷菌RPB03菌株,得到了類似的結果,對土壤有效磷提升量增加了14.33 mg/kg,實驗植物的株高及植物干重增加顯著,具有促進植物生長的效果。當然,在自然環境條件下,該溶磷細菌提升鹽漬土壤肥力效果、機理及措施還需進一步研究。

4 結論

通過研究酸堿度、溫度、鹽度(NaCl)、轉速(充氧量)、氮源及碳源等環境因子對RPB03菌株溶磷能力影響,表明該菌溶磷能力顯著,在較高的酸堿度、鹽度及較高的溫度下,依然表現了良好的溶磷能力,在黃河三角洲鹽漬土壤生境中具有潛在的適應性；同時,該菌能夠顯著提高測試土壤的有效磷含量,從對黃河三角洲鹽堿地肥力提升方面來看,具有良好的開發前景。