超聲介導FGF21納泡保護糖尿病小鼠心功能的研究

高嘉夢 孟哲穎 李雁鳴 赫 蘭 胡 兵 申 鍔

糖尿病患者無癥狀左心室功能不全和心力衰竭發生率很高，因心力衰竭的住院率和病死率逐步增加[1]。心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)21是一種治療代謝綜合征的藥物。在肥胖和2型糖尿病的臨床前模型中，使用FGF21治療可以改善血糖穩態并促進體重減輕[3]。同時，在1型糖尿病模型中，FGF21通過顯著抑制糖尿病小鼠的心臟凋亡，預防心臟重構和心臟功能紊亂[4]。本研究利用超聲介導FGF21納泡對糖尿病小鼠進行預防性治療，觀察其對小鼠心臟結構和功能的影響。

材料與方法

1.主要試劑與儀器：端羧基聚乳酸乙醇酸共聚物(濟南岱罡生物工程有限公司)，聚醚酰亞胺(上海阿拉丁公司)，聚乙烯醇(美國Sigma公司)，八氟丙烷(上海眾巍化學有限公司)，FGF21蛋白(北京義翹神州公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，納米粒度Zeta電位儀(美國Omni公司)，高分辨場發射掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)，多模式小動物超聲(美國Fujifilm公司)，血糖測試儀(德國羅氏公司)。

2.FGF21納泡制備及其質量評價：采用雙乳化法制備FGF21納泡。具體過程如下：聚乳酸乙醇酸共聚物溶于二氯甲烷作為油相，加入雙蒸水作為水相，經過聲振形成初次乳化液；向初次乳化液中加入溶解于聚乙烯醇的聚醚酰亞胺，經過聲振形成二次乳化液。使用旋轉蒸發儀揮發有機溶劑，洗滌3次后獲得納泡；加入FGF21溶液于搖床孵育，離心洗滌獲得FGF21納泡溶液，經冷凍干燥得FGF21納泡凍干粉，加壓注入八氟丙烷氣體和0.9%氯化鈉注射液充分振蕩即可使用。

取少量稀釋的FGF21納泡滴在載玻片上，于顯微鏡觀察；滴在硅片上，風干、噴金，于掃描電鏡觀察。同時用納米粒度Zeta電位儀分別測定載藥及空白納米其粒徑和Zeta電位。

3.動物模型建立及實驗分組：SPF級雄性C57BL/6J小鼠，6周齡，體質量18～20g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。48只小鼠適應性飼養達8周齡后，隨機選擇40只小鼠經腹腔一次性注射STZ(150mg/kg)建立DM模型，其余作為對照組。DM小鼠隨機分為4組，即DM組、FGF21組、FGF21納泡組和FGF21納泡+超聲組，每組10只。72h后隨機尾靜脈取血測定血糖，血糖≥16.7mmol/L且伴有多飲、多食及多尿現象即建模成功。

4.治療方法：各組小鼠經6%水合氯醛腹腔注射麻醉后，心前區備皮，對照組及DM組經尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，FGF21組和FGF21納泡組小鼠分別經尾靜脈注射相應劑量FGF21和FGF21納泡。FGF21納泡+超聲組小鼠經尾靜脈注射FGF21納泡，同時在心前區放置超聲探頭進行定點靶破。其中超聲參數設置為頻率500kHz，聲壓2W/cm2，時間5min；在建模成功后開始治療，每次FGF21給藥劑量達100μg/kg，各組小鼠持續給藥8周，1周2次。

5.超聲心動圖檢查：實驗到達終點時，小鼠誘導麻醉。于胸骨旁左心室長軸M型超聲測量分析小鼠左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

6.HE染色：將取小鼠左心室壁心肌組織于固定、脫水透明、包埋、切片備用。取切片脫蠟、脫水，依次蘇木精、伊紅染色后封片，于顯微鏡下觀察心肌細胞。

7.天狼星紅染色：取石蠟切片脫蠟、脫水，天狼星紅染色封片。于顯微鏡下觀察，膠原纖維呈紅色。隨機選取3個400倍視野，計算心肌膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)。

結 果

1.FGF21納泡的質量評價：光學顯微鏡和掃描電鏡觀察FGF21納泡呈大小均一、分布均勻的圓球形結構。納米粒度Zeta電位儀測量空白和載藥納泡的粒徑分別為877.5±23.6nm和933.2±27.4nm，粒徑的多分散性指數分別為0.106和0.168，均<0.2，表明本研究制備的空白及載藥納泡分散性好。Zeta電位結果顯示，空白和載藥納泡的Zeta電位分別為17.44±1.81mV和2.73±1.93mV，表明FGF21蛋白成功負載納泡表面，詳見圖1～圖4。

圖1 光學顯微鏡下FGF21納泡(×40)

圖2 透射電鏡下FGF21納泡(×25000)

圖3 空白納泡與FGF21納泡粒徑分布

圖4 空白納泡與FGF21納泡Zeta電位

2.超聲心動圖評價小鼠心臟功能結果：糖尿病模型建立8周后，與對照組比較，DM組小鼠LVEF、LVFS顯著降低(P<0.05)；藥物干預性治療8周后，與DM組比較，FGF21組、FGF21納泡+超聲組小鼠LVEF、LVFS顯著升高(P<0.05)；與FGF21組比較，FGF21納泡+超聲組顯著升高(P<0.05)；而FGF21納泡組與DM組小鼠心臟功能指標比較，差異無統計學意義，詳見表1。

表1 各組小鼠超聲心動圖指標測量結果

3.各組小鼠心肌組織HE染色結果：對照組小鼠心肌細胞排列規則，細胞核大小均一；與對照組比較，DM組小鼠心肌細胞明顯肥大，心肌細胞排列紊亂，細胞核增大；與DM組比較，FGF21組、FGF21納泡+超聲組小鼠心肌細胞肥大程度降低,其中FGF21納泡+超聲組心肌細胞肥大程度降低最顯著，心肌排列較規則；而FGF21納泡組心肌細胞肥大降低程度與DM組比較，差異無統計學意義，詳見圖5。

圖5 各組小鼠心臟組織HE染色結果(×40)A.對照組；B.DM組；C.FGF21組；D.FGF21納泡組；E.FGF21納泡+超聲組

4.各組小鼠心肌組織天狼星染色結果：天狼星紅染色結果顯示心肌膠原纖維呈紅色。與對照組比較，DM組小鼠心肌CVF顯著升高(9.67%±1.11% vs 1.07%±0.16%，P<0.05)；與DM組比較，經過FGF21和超聲介導FGF21納泡干預后，各組小鼠心肌CVF下降(9.67%±1.11% vs 5.04%±0.28%、3.35%±0.36%，P<0.05)；與FGF21組比較，FGF21納泡+超聲組心肌CVF顯著下降(P<0.05)。FGF21納泡組(8.10%±0.48%)與DM組比較，差異無統計學意義，詳見圖6。

圖6 各組小鼠心臟組織天狼星染色結果(×40)A.對照組；B.DM組；C.FGF21組；D.FGF21納泡組；E.FGF21納泡+超聲組

結 果

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要心臟并發癥，其發生不依賴于冠狀動脈病變、高血壓或其他心臟疾病，具有高發生率和高風險特征[5]。DCM最初表現為舒張功能障礙，隨后發展為以各種代謝和神經體液途徑紊亂為特征的收縮功能障礙[6]。1型糖尿病相關的DCM，其特征是心肌細胞肥大、心肌膠原沉積和左心室重構，導致左心室舒張末期容量增加，心臟收縮功能受損[7]。臨床發現傳統的治療方法，如降糖藥、改善心功能等，不能從根本上改善臨床癥狀或治愈DCM。

FGF21在調節各種基本生理代謝過程中發揮關鍵作用，如降低血糖水平，降低肝臟和血清中甘油三酯水平[8]。越來越多的證據表明外源性FGF21對心血管疾病有保護作用。FGF21通過減輕氧化應激、減少心肌細胞炎癥、促進脂肪酸氧化、抑制心肌細胞凋亡等從而改善心肌能量供應和減輕病理性心肌重構，預防甚至逆轉糖尿病心肌病[9]。然而，外源性FGF21作為生物大分子具有一定的缺陷，如在體內易降解、生物利用度低等，并且具有多器官效應，限制其對心臟保護作用。

微泡/納泡作為藥物遞送的載體，可以保護血液中藥物不被降解，延長循環血藥濃度、增加藥物的生物利用度。微泡/納泡遞送藥物的形式多種多樣，藥物可以通過共價鍵或非共價鍵結合在微泡表面，可以被包覆在核心，也可以通過脂質體、聚合物等結合后附著在微泡/納泡表面[10]。超聲由于可以通過細胞膜控制治療藥物的遞送，已經成為一種具有前景的治療手段。當含氣微泡/納泡暴露在超聲波下時，發生膨脹與收縮，導致周圍的液體快速流動，對周圍組織產生機械作用，導致可逆性的細胞膜通透性升高，從而促進藥物釋放和通過細胞膜外滲[11]。

本研究根據前期實驗的雙乳化法，通過非共價結合方式合成載FGF21納泡[12]。已有研究證實，聚乳酸乙醇酸共聚物因具有良好的生物相容性和優良的藥代動力學特性等優點而成為廣泛應用的成膜材料，聚醚酰亞胺修飾的聚乳酸乙醇酸共聚物納米顆粒具有正電荷，與DNA/蛋白質靜電結合，比制備陽離子脂質體更穩定、更易操作[13]。通過對載藥的納泡的質量考察證實，本研究制備的載FGF21納泡大小均一，分散性、穩定性好。通過反復加壓注入八氟丙烷氣體后，實現體內超聲成像和超聲靶向治療作用[14]。整個制備過程在低溫中完成，保證蛋白藥物的生物活性。在小鼠尾靜脈給藥同時，于心臟局部施加低頻超聲，實現載FGF21納泡在心肌組織中的定點靶向釋藥。

為了證實載FGF21納泡結合超聲靶向治療的有效性，本研究通過心臟超聲檢查，評估超聲結合FGF21納泡對糖尿病小鼠心臟的保護作用。實驗發現，藥物干預性治療8周后，與DM組比較，FGF21組、FGF21納泡+超聲組小鼠LVEF、LVFS顯著升高，與FGF21組比較，FGF21納泡+超聲組左心收縮功能改善更加顯著升高，而FGF21納泡組與DM組小鼠心臟功能指標比較，差異無統計學意義。心肌肥大、心肌纖維化是心功能減低的重要原因。同時，心肌病理組織觀察結果也證實如此，低頻超聲介導的FGF21納泡可顯著抑制糖尿病誘導的心肌組織損害和心臟重構。分析其原因可能為FGF21納泡在通過心臟血管時，在超聲波聲能下產生空化效應，促使FGF21蛋白的釋放，同時在機械力作用下，血管內皮細胞間隙增寬和心肌細胞膜形成可逆性孔道，使得更多的FGF21進入心肌細胞發揮作用發揮生物效應[15]。而FGF21納泡組，由于缺乏超聲作用以及納泡的保護，釋放入血循環發揮生物效應的蛋白量更少，因此其對心臟的保護作用較弱。

綜上所述，本研究證實糖尿病小鼠心肌組織發生明顯的纖維化，心室順應性減弱，由此出現心功能下降現象。FGF21由于具有預防病理性心肌重構，FGF21納泡與低頻超聲的結合應用，對糖尿病誘導的心臟功能不全發揮積極預防保護作用，有望成為治療糖尿病心肌病的一種新的手段。