索拉菲尼對腎癌細胞的抑制作用與STC-1調控細胞內鈣穩態的關系研究

沈亞楠 谷 江 張永春 羅浩鳴

靶向藥物在靶向抑制腎癌細胞時，腎癌細胞會產生一定的抵抗作用，導致藥物的抑制效果逐漸減弱，但具體的抵抗機制尚未明確[1]。研究發現腎癌細胞中有STC-1蛋白的存在[2]。STC-1即斯鈣素蛋白1，是最早在魚類體內發現的一種糖蛋白激素，主要調節體內鈣磷代謝[3]。STC-1以濃度依賴的方式刺激線粒體鈣轉運[4]。有研究指出，STC-1調節鈣穩態的過程可能參與腎癌細胞對靶向藥物的抵抗[5]。

所謂鈣穩態是指細胞內液和細胞外液的離子鈣水平穩定[6]。鈣穩態是影響腫瘤細胞增殖和存活的重要因素[7]。索拉菲尼能夠抑制腫瘤血管生成，引起腫瘤細胞缺氧，容易導致細胞內Ca2+超載，造成細胞損傷，而STC-1可能是一種抗凋亡和致癌因子，所以創新性地將STC-1調控鈣穩態引入到腎癌細胞抵抗靶向藥物的研究中，觀察這種抵抗作用是否與STC-1調節鈣穩態相關，或能為逆轉腎癌細胞的耐藥性提供新的思路[4，8]。

材料與方法

1.主要材料與儀器：1640培養基、青鏈霉素混合液、PBS(磷酸緩沖鹽溶液)購自美國Hyclone公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA購自美國Gibco公司；MTT試劑盒購自凱基生物體；DMSO(二甲基亞砜)購自美國AMRESCO公司；索拉菲尼購自德國拜耳公司；總RNA提取試劑盒購自美國Fermentas 公司；ELLSA試劑盒購自美國R&D公司；9孔板、15ml及50ml離心管購自康寧公司；酶標儀(elx808)購自美國Thermo公司；低速離心機(SC-3612型)購自中佳公司；Fura-2 AM鈣離子探針購自碧云天生物技術研究所；人腎癌GRC-1細胞購自上海弗雷堡生物公司。

2.培養液的配制：在50ml的離心管中加入500μl的青霉素、鏈霉素混合物、5ml的胎牛血清以及1640培養基，制備含有1%青霉素鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養液。

3.細胞培養：在1640培養基中培養人腎癌GRC-1細胞，置于37℃和5%CO2飽和濕度的培養箱中，細胞附壁后，每2天傳代1次，培養至對數生長期進行實驗。

4.MTT法檢測索拉菲尼對腎癌細胞增殖的影響：取對數生長期的腎癌細胞，以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，培養24h并加入藥物。實驗分為：索拉非尼(1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L)用藥組和不加藥的對照組。為每個劑量設置5個重復孔，添加藥物后培養24h，然后向每個孔中添加20μl MTT(5mg/ml)，繼續培養4h，然后終止培養，棄上清液，向每孔加入DMSO 150μl，低速振蕩10min以完全溶解晶體。最后，使用酶標儀在490nm處測量每個孔吸光度(A)值，并計算每組藥物對細胞增殖的抑制率，抑制率(%)=(1- 實驗組A值/對照組A值)×100%。

5.反轉錄PCR測定STC-1基因表達：采用RT-PCR法測定各組細胞的STC-1基因表達水平，用試劑盒提取各組細胞的總RNA，取1μg RNA進行反轉錄并合成cDNA。引物序列β-actin,正向5′-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3′，反向5′-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3′，片段長度531bp；STC-1，正向5′-TGAGGTCGTCCAGCTCCCAATC-3′，反向5′-GGCACAGTGGTCTGTCTGCAGGATG-3′，片段長度142bp。RT-PCR 反應條件:預變性94℃ 3min，變性94℃ 30s，退火53℃ 30s，延伸72℃ 1min，35個循環后，終止反應72℃ 5min；以β-actin作為內部參照，PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，并用凝膠成像儀照相。

6.采用ELLSA法測定各組細胞STC-1蛋白表達：使用PMSF和細胞裂解液裂解每組細胞，以12000 r/min轉速離心5min，取上清液，并以50微升/孔滴加到酶標板中，設置空白孔、標準孔和樣品孔分別進行測試。按試劑盒說明書(美國R&D公司)操作，并使用酶標儀進行檢測，根據獲得的標準曲線計算STC-1蛋白表達水平。

7.熒光分光光度法測各組細胞內Ca2+含量：不同濃度索拉非尼干擾腎癌細胞24h并消化成細胞懸液，以1000r/min離心5min，棄上清液，將細胞重懸于含0.2%小牛血清白蛋白的D-Hanks溶液中，調整細胞數約為8×105/ml。加入Fura-2/AM，37℃避光孵育45min。用D-Hanks溶液洗滌細胞2次，再將細胞重懸于3ml D-Hanks溶液中，雙波長熒光分光光度計測量細胞熒光強度。

8.化學比色法測定Ca2+-ATP酶活性：ATPase可以分解ATP產生ADP和無機磷，通過測試無機磷的含量來確定ATPase的活性水平，以1mg/h的ATP酶分解ATP產生1μmol的Pi量為1個ATP酶活力單位，即1μmol/(mg·h)。嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

結 果

1.索拉菲尼對腎癌細胞增殖的影響：MTT法的結果表明，隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，但以藥物濃度10μmol/L為轉折點，抑制率趨于穩定，但均高于中低濃度組，中低濃度組之間比較，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。腎癌細胞抑制率呈逐漸上升趨勢，但以10μmol/L為濃度轉折點，細胞抑制率逐漸趨向平穩。

表1 不同濃度索拉菲尼對腎癌細胞增殖的抑制作用

2.RT-PCR檢測腎癌細胞內STC-1mRNA表達水平：各組細胞中STC-1mRNA的表達逐漸增加，從10μmol/L藥物濃度開始增加更為明顯，差異有統計學意義(P<0.05，圖1，表2)。

表2 各組細胞內STC-1mRNA與STC-1蛋白表達水平

圖1 索拉菲尼干預腎癌細胞后STC-1的基因表達

3.ELISA法檢測STC-1蛋白表達量：各組細胞內STC-1表達量逐漸增高，并在10μmol/L藥物濃度時增量較明顯，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

4.熒光分光光度法測各組細胞內Ca2+含量：各組細胞內Ca2+逐漸增加，從10μmol/L的藥物濃度開始趨于穩定，中低濃度組兩兩比較后差異均有統計學意義(P<0.05，表3)。

5.化學比色法測定各組細胞內Ca2+-ATPase 活性：各組細胞內鈣酶活性逐漸下降，從10μmol/L藥物濃度開始趨于穩定，中低濃度組兩兩比較后差異均有統計學意義(P<0.05，表3)。

表3 各組細胞內Ca2+含量與Ca2+-ATPase 活性

結 果

目前，靶向治療可顯著延長晚期腎癌患者的無進展生存期和總體生存期，并顯著改善患者的預后[9]。索拉菲尼因其自身在抗腫瘤活性及藥物耐受性上表現優異，是晚期腎癌靶向治療的一線用藥，但相關研究發現，索拉菲尼的長期使用會伴隨耐藥性的出現，嚴重影響治療效果[10，11]。結合索拉菲尼在抑制腎癌細胞時出現STC-1異常變化及鈣穩態改變的相關報道，本實驗以STC-1作為切入點，研究索拉菲尼抑制腎癌細胞時STC-1與細胞鈣穩態變化之間的關系，并探討對腎癌細胞增殖的影響。

索拉菲尼抑制腎癌細胞時，會引起細胞內鈣離子的變化，鈣離子受到STC-1的調控[12]。STC-1在促進腎癌的發生和發展中起著重要作用，但尚未明確[13]。STC-1調節鈣穩態機制是否參與了索拉菲尼對腎癌細胞的抵抗作用亦不清楚，因此通過本次實驗進行了研究，筆者研究發現隨著索拉菲尼濃度的依次遞增，細胞內Ca2+含量、鈣酶活性及STC-1圍繞濃度轉折點發生規律性變化。這表明，STC-1可能通過調控Ca2+水平，避免鈣超載引起的細胞凋亡。

作為儲存Ca2+的主要場所，線粒體支持的生物學功能通常由Ca2 +控制，Ca2+水平紊亂可能會加劇線粒體功能障礙和能量衰竭，從而促進細胞死亡[14]。作為細胞中重要的第二信使，Ca2+參與調節細胞增殖、凋亡、基因轉錄、細胞分泌，并能調節血管內皮細胞功能[15，16]。Ca2+通過啟動內皮細胞中信號，對控制血管張力和內皮通透性有重要作用[17]。血管內皮細胞通過質膜Ca2+-ATPase和Na+/Ca2+交換將細胞質中過量的Ca2+移至細胞外，從而維持細胞的鈣穩態[18]。Ca2+-ATPase(PMCA)活性的降低導致鈣離子在細胞質中積累，而腎細胞中PMCA是主要的鈣輸出蛋白，因此可以測定腎癌細胞PMCA活性反映鈣穩態情況[19]。

鈣離子水平增高可能會引起STC-1的變化。STC-1被證明在腎臟中高表達，并關鍵性地調節細胞生長、增殖和分化，以及調節鈣穩態[20]。STC-1可以下調鈣離子水平，維持鈣離子穩定，促進細胞生長[21]。因此，隨著索拉非尼濃度的遞增，可能會引起STC-1升高以拮抗過多的Ca2+水平，使鈣離子代謝趨向穩定，因為鈣離子代謝可以影響細胞能量代謝，而能量代謝也可能是STC-1直接影響所致，這種影響會反映到對細胞的抑制作用逐漸趨向平穩甚至減弱，這也可能是腎癌細胞對索拉菲尼產生抵抗的原因之一。

本實驗研究提示腎癌細胞對靶向藥物產生的抵抗作用可能與STC-1調控鈣離子穩態有關，也可能直接與STC-1相關，故STC-1可能是腎癌治療的有效靶點，抑制STC-1可能會逆轉腎癌細胞對靶向藥物的耐藥性。然而本實驗僅是針對基因進行檢測，而沒有進行干預，而且細胞實驗脫離了全機體的綜合調控，因此只是提供一個依據；而其中深層機制的確定，可能需要培養耐藥細胞進行更細致的檢測和驗證，因此后續尚需開展深入的研究予以進一步證實。