利用InSyTe FLECT/CT成像技術動態觀察急性肺結核小鼠感染模型的構建

李軍麗 石亞男 占玲俊

闡明結核病發病機制，評估抗結核新藥、疫苗和診斷試劑的實驗研究中，動物模型是最有效且不可或缺的工具。目前，結核病小鼠模型的建立主要通過氣溶膠霧化吸入、滴鼻、腹腔注射及尾靜脈注射等常用感染方法，評價模型建立成功與否的金標準則是依照科赫法則(koch postulates)對靶器官荷菌量進行檢測[1～3]。而就小鼠的數量、ABSL-3實驗室空間以及實驗過程中不同時間點獲取和培養的動物組織所需其他資源而言，依賴靶器官菌落形成單位(colony-forming units，CFU)計數的常規終點即繁瑣又昂貴，且增加了操作過程中的生物安全風險。同時，結核分枝桿菌生長緩慢，需要3～4周時間才能在固體培養基上形成肉眼可見的菌落，這嚴重阻礙了結核病疫苗和藥物的研發速度。因此，需要一種可靠的非侵入性實時定量方法，可以在體外和活體動物中定量分析活的結核分枝桿菌，以縮短預防和治療藥物的篩選周期。

活體動物體內光學成像是近年來發展起來的新技術，通過活體生物發光或熒光成像，研究者能夠直接觀測熒光標記的活細胞或病原體在動物體內的生物學行為，目前已成為廣泛應用于醫學、生物學及藥物開發等研究領域的前沿技術[4,5]。該技術對疾病動物模型微小病灶的檢測敏感度極高，能夠進行無創、實時、動態的動物活體觀察，能更加準確地反映傳染病動物模型中病原體在宿主體內定位及增殖情況，獲得的實驗結果更加直觀可靠[6,7]。此外，對同一實驗對象進行不同時間點的反復跟蹤和動態觀察，避免實驗動物間的個體差異及減少實驗動物的使用量，使科學研究更加符動物實驗倫理中有關動物福利的替代、減少、優化的“3R”原則[8]。

目前，各種熒光素酶生物標記的細菌已用于高通量篩選抗生素和對分枝桿菌的藥敏試驗，且取得了不少成果[9,10]。本研究通過構建穩定表達近紅外熒光蛋白的減毒牛型結核分枝桿菌，并利用InSyTe FLECT/CT多模態成像平臺中將熒光斷層成像與X線CT掃描相結合的優勢，對不同感染途徑下急性肺結核小鼠感染模型的建立進行可視化動態觀察，為分枝桿菌在體內生長、轉移及結核病治療研究提供理想的動物模型。

材料與方法

1.質粒、菌種與動物：pMV261質粒，E.coli DH5α，Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2由上海晶諾生物科技有限公司提供，RAW264.7細胞由筆者所在實驗室保存。6～8周齡SPF級雌性C57BL/6N小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京)-2016-0006]。

2.主要試劑：7H9培養基、7H10培養基、Middlebrook OADC增菌液購自美國BD公司，T4 DNA連接酶、Fast Digest HindⅢ、Fast Digest EcoRⅠ、Phusion?High Fidelity DNA Polymerase (2U/μl)購自美國Thermo Fisher公司，質粒提取試劑盒購自天根生物公司，膠回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒購自美國Omega公司，Trans2K Plus Ⅱ DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3.熒光質粒構建：高保真聚合酶Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase PCR擴增iRFP720基因，引物iRFP720-FP/iRFP720-RP分別為：5′-TCCAGCTGCAGAATTCATGGCTGAAGGATCCGTCGC-3′/5′-CGACATCGATAAGCTTTCACTCTTCCATCACGCCGA-3′，反應體系及擴增條件參考產品說明書。擴增目的DNA片段后，瓊脂糖核酸凝膠電泳回收純化目的DNA片段。回收后的目的DNA片段與EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切線性化的pMV261質粒經無縫克隆重組并轉化E. coli DH5α感受態細胞。篩選陽性克隆子pMV261-iRFP720并測序驗證，陽性質粒保存備用。

4.BCG感受態菌株制備：挑取新鮮的Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2(簡稱BCG)單菌落接種于5ml 7H9 + OADC液體培養基，37℃靜置培養3～4周，至菌體的對數生長期(A600為0.6左右)。室溫5000r/min離心10min收集菌體，10%無菌甘油洗滌菌體3次，最后經10%無菌甘油重懸菌體，每管200μl分裝置-80℃凍存備用。

5.電擊轉化BCG感受態細胞：10μl陽性pMV261-iRFP720質粒加入200μl BCG感受態菌株中，混勻后室溫靜置10min，隨后轉入2mm電轉杯中電擊，電擊參數為：電壓2.5kV, 電阻1000Ω，電容25μF。電擊完畢后，立即加入1ml 7H9+OADC液體培養基，37℃復蘇12h。室溫5000r/min離心10min，棄上清，200μl 7H9+OADC液體培養基重懸菌體并均勻涂布至含25μg/ml卡那霉素的7H10+OADC固體平板，37℃恒溫培養。

6.BCG-iRFP720熒光菌株驗證：37℃培養3～4周后，挑取單克隆菌株接種至含25μg/ml卡那霉素的7H9 + OADC液體培養基，37℃培養4～5周，收集菌體煮沸裂解，以裂解液為模板，PCR驗證質粒是否轉入菌株中，陽性菌株即為構建成功的Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株(簡稱BCG-iRFP720)。PCR驗證引物JDFP/JDRP分別為：5′-GTGGCAGCGAGGACAACTTG-3′/5′-CCCGACGTCAGGTGGCTAG-3′。

7.熒光菌株體外細胞實驗：RAW264.7細胞傳代至24孔細胞培養板(1×105cells/ml，100微升/孔)，37℃、5% CO2培養5～6h。300μl DMEM培養基洗去未貼壁細胞，每孔細胞補加500μl DMEM完全培養基，同時加入100μl(1×106CFU/ml)BCG-iRFP720熒光菌株。呈米字形搖勻后，37℃分別靜置培養24h和48h，300μl無菌PBS洗去凋亡細胞和未被吞噬的熒光菌株，隨后進行熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

8.熒光菌株體內動物實驗：C57BL/6N小鼠隨機分成3組，即空白對照組、熒光菌株腹腔注射感染組和熒光菌株尾靜脈注射感染組，每組6只小鼠。腹腔注射和尾靜脈注射感染組分別經腹腔和尾部靜脈注射100μl(1×107CFU/ml)BCG-iRFP720熒光菌株，而空白對照組接種等劑量BCG菌株。感染后1、3、5和7天分別進行InSyTe FLECT/CT活體成像。同時，解剖感染后7天小鼠肝臟、脾臟和肺進行器官離體熒光成像進行驗證。全部動物實驗操作經筆者單位實驗動物管理和使用委員會(IACUC)批準，批準號為ZLJ2019001。

結 果

1.BCG-iRFP720熒光菌株構建及驗證：目的基因iRFP720與經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的游離型載體pMV261質粒重組，并轉化至E.coli DH5α感受態細胞。抽提質粒并測序驗證，陽性質粒pMV261-iRFP720通過電擊轉化方法轉入BCG菌株中，獲得熒光菌株，最終通過利用載體上來源于結核分枝桿菌的hsp60基因啟動子實現iRFP720基因的表達(圖1A)。以抗卡那霉素單克隆陽性BCG菌體裂解液為模板，PCR驗證電泳結果顯示，pMV261-iRFP720質粒成功轉入BCG菌株，獲得BCG-iRFP720熒光菌株(圖1B)。

圖1 BCG-iRFP720熒光菌株構建及PCR驗證A.Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株構建流程；B.PCR驗證pMV261-iRFP720質粒轉染BCG菌株；M.DNA marker；1.PCR驗證BCG中含有pMV261-iRFP720質粒

2.BCG-iRFP720在體外細胞中的熒光信號：pMV261-iRFP720質粒導入BCG菌株，使得該菌株具備激發出紅色熒光的特性，不同濃度菌懸液熒光成像顯示，菌體紅色熒光明顯(圖2A)。為進一步檢測在細胞水平下該菌株的熒光表達情況，對數生長期熒光菌株BCG-iRFP720以MOI為10感染RAW264.7細胞，37℃共孵育24h和48h后，分別進行熒光顯微觀察。如圖2B所示，BCG-iRFP720熒光菌株侵染RAW264.7巨噬細胞后可在細胞中持留并可見明顯紅色熒光。同時，被BCG-iRFP720熒光菌株感染的細胞形態均有變圓趨勢，但隨著吞噬時間的延長，紅色熒光強度有所減弱。

圖2 BCG-iRFP720菌體及其在RAW264.7胞內熒光強度檢測A.不同濃度Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2:: pMV261-iRFP720菌株(1×108CFU/ml到1×103CFU/ml, 100微升/孔)自體熒光強度檢測；B.對數生長期Mycobacterium bovisBCG str. Pasteur 1173P2:: pMV261-iRFP720熒光菌株感染RAW264.7巨噬細胞24和48h后，胞內熒光強度檢測

3.腹腔注射BCG-iRFP720在活體動物上的熒光信號：小鼠經腹腔注射感染BCG-iRFP720熒光菌株后，InSyTe FLECT/CT小動物多模態光學成像系統分析其在680通道波段(激發波長為670nm，發射波長為690～740nm)下的活體熒光成像。結果顯示，BCG-iRFP720菌株注射后1、3、5和7天小鼠腹腔均可見明顯熒光。隨著注射感染時間延長，菌株開始由腹腔注射部位遷移擴散至胸腔及其他部位。并在感染后的第5天，可見胸腔肺部明顯熒光(圖3)。

圖3 腹腔注射BCG-iRFP720菌株后小鼠活體熒光成像小鼠經腹腔注射100μl的1×107CFU/ml Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株后，不同時間點(1、3、5和7天)小鼠活體熒光成像分析。上圖為小鼠正位三維圖像，下圖為小鼠肺部CT斷層圖像(橫斷面)

4.尾靜脈注射BCG-iRFP720在活體動物上的熒光信號：BCG-iRFP720菌株經腹腔注射感染后第5天，熒光菌株由腹腔擴散至肺部，為進一步比較不同感染途徑在建立急性肺結核模型上的差異，同等劑量熒光菌株經尾靜脈注射感染小鼠并進行活體熒光成像動態觀察。尾靜脈注射感染后第1天，小鼠胸腔肺部即出現明顯熒光，且隨著感染時間的延長，肺部熒光逐漸增強(圖4)。表明尾靜脈注射感染后熒光菌株隨血液循環至小鼠各臟器部位，且感染后1天左右即可構建急性肺結核小鼠感染模型。

圖4 尾靜脈注射BCG-iRFP720菌株后小鼠活體熒光成像小鼠經尾靜脈注射100μl的1×107CFU/ml Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株后，不同時間點(1、3、5和7天)小鼠活體熒光成像分析。上圖為小鼠正位三維圖像，下圖為小鼠肺部CT斷層圖像(橫斷面)

5.BCG-iRFP720在離體器官上的熒光信號：為明確和驗證不同感染途徑下BCG-iRFP720熒光菌株在小鼠體內的分布情況，小鼠感染后7天，解剖分離肺、脾臟和肝臟進行離體組織器官熒光成像。腹腔注射感染后7天，BCG-iRFP720熒光菌株由腹腔擴散遷移至肺部和肝臟，離體器官熒光成像顯示肺部和肝臟呈現明顯紅色熒光，但未見脾臟紅色熒光出現(圖5A)。尾靜脈注射感染后7天，BCG-iRFP720熒光菌株迅速擴散遷移至肺、肝臟和脾臟，熒光成像可見肺、脾臟、肝臟等組織器官呈現明顯紅色熒光，且肝臟熒光強度更顯著(圖5B)。

圖5 不同感染途徑下BCG-iRFP720菌株在小鼠肺、脾臟和肝臟分布情況小鼠經腹腔和尾靜脈注射100μl的1×107 CFU/ml Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株后7 天，解剖分離小鼠肺、脾臟和肝臟進行離體器官熒光成像分析

結 果

活體動物體內光學成像主要采用生物發光成像與熒光發光成像兩種技術[11]。生物發光是將熒光素酶基因(luciferase)整合到細胞染色體上，使熒光素酶得到持續表達。觀察前經外源途徑注射其底物-熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內產生發光現象。該類酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發光，且注射一次熒光素只能保持體內熒光素酶標記的細胞發光30～45min。熒光發光則有多種方式，既可以將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)等熒光報告基團或其突變體基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光蛋白，在激發光源的作用下而發光，也可以利用一些熒光染料標記特定的物質，注入小動物體內而發光。相比生物發光，熒光發光成像具有發光持續性強、無需外源反應底物或輔助因子參與、費用低廉且操作簡單等優點。

近紅外熒光蛋白是基于光敏素蛋白改造的新型熒光蛋白，近紅外光源波長范圍為700～900nm，為人類最早發現的非可見光區域[12]。本研究將近紅外熒光蛋白基因iRFP720克隆至游離型載體pMV261質粒，最終電轉至減毒牛型結核分枝桿菌，通過利用pMV261載體上來源于結核分枝桿菌的hsp60基因啟動子實現iRFP720基因的表達。體外菌體、胞內感染以及動物體內感染實驗均表明，在激發波長為670nm，發射波長為690～740nm，構建的熒光菌株均能被有效激發出紅色熒光，且持續時間較長。熒光發光是通過激發光激發熒光基團到達高能量狀態，而后產生發射光，動物體內很多物質如皮毛、血液和脂肪等在受到激發光激發后也會發出熒光，產生的非特異性熒光會影響到檢測敏感度[13]。但研究表明，機體在近紅外光波段的吸收系數最小、自發熒光最弱且相比于藍綠光其在體內的穿透性效率高[14～16]。因此，利用表達的iRFP作為標志物，對細菌等生物基本功能單位在空間和時程上的改變進行活體熒光成像成為最佳選擇。

在結核病研究中，新型抗結核藥物的迫切需求促使藥物快篩創新方法的出現以加快藥物開發進程[17～19]。傳統的結核病小鼠模型在抗結核藥物快速篩選早期存在顯著瓶頸，部分原因是動物模型中結核菌負擔以靶器官組織勻漿CFU來衡量，而結核分枝桿菌在體外復制時間長，固體培養基上生長成肉眼可見菌落可能需要長達4周左右。InSyTe FLECT/CT多模態成像系統采用業界首創的旋轉機架式全角度熒光斷層成像技術，可以在完整的360°范圍內獲取CT和熒光數據，實現深層組織的無放射性同位素分子成像[20]。同時，其高敏感度、非損傷性、獲取時間短、可實時提供疾病進展和治療效果替代讀數等優點，彌補了上述傳統方法所處的困境，特別適合在小鼠中快速篩選候選藥物。本研究利用構建成功的近紅外BCG-iRFP720熒光菌株，借助InSyTe FLECT/CT多模態成像系統觀察腹腔注射和尾靜脈注射感染途徑下熒光菌株在體內的分布情況，一方面比較兩種感染途徑在建立急性肺結核感染模型中的差異，利用其可視化的優點，準確定位菌株到達小鼠肺部情況。另一方面，充分獲取InSyTe FLECT/CT多模態成像系統各類分析參數，為下一步長期觀察H37Ra、H37Rv等有毒分枝桿菌可視化模型奠定基礎。

綜上所述，本研究成功構建了穩定表達近紅外熒光蛋白的減毒牛型結核分枝桿菌菌株，并且運用InSyTe FLECT/CT多模態成像系統對不同感染途徑構建的小鼠模型進行了比較觀察，為結核藥物快速篩選提供了可視化模型，也為今后在疾病模型研究中選擇實驗動物的活體影像學監測手段積累經驗。