NLRP3基因多態性與漢族男性原發性痛風的關系

迪麗拜爾·阿吉木 王宇婷 葉 飛 苗 蕾

痛風是一種以嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起的代謝性疾病，痛風患者常伴發高血糖、高血壓、高血脂、肥胖等多種疾病。近年來隨著人民生活水平的提高，飲食習慣和飲食結構的改變，痛風的發生率呈逐年增長趨勢，并且呈年輕化趨勢，嚴重危害患者的身體健康[1]。研究發現，飲酒和富含高嘌呤飲食是男性痛風發作的主要誘因之一。30多年來,不論是歐美國家還是亞洲國家,痛風和高尿酸血癥發生率均有明顯增長[2,3]。目前全球痛風發生率為0.1%～10.0%,而我國痛風發生率約為2%[4]。美國人群痛風的發生率約為3.9%，法國為0.9%，英國為1.4%～2.5%，德國為1.4%[5]。

血清尿酸鹽濃度的升高是痛風性關節炎最危險的因素之一，導致尿酸單鈉(MSU)晶體沉積，主要沉積在周圍關節內和周圍組織，損害關節。血清尿酸鹽濃度的升高與環境因素及遺傳因素相關[6]。環境因素包括攝入啤酒、肉類和海鮮等富含嘌呤的食物，攝入會增加嘌呤核苷酸降解的果糖，自身的體重指數(BMI)過高以及有利尿藥物服用史，最終導致尿酸產生過剩[7]。多項研究顯示，遺傳因素在原發性痛風中具有重要作用，并且已經發現20余個遺傳易感位點[8～10]。NLRP3是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族含熱蛋白結構域亞成員，被證明參與慢性感染炎癥性疾病的先天免疫反應[11]。本研究中筆者將290例漢族男性痛風患者和302例健康對照者作為研究的對象，評估了痛風組和健康對照組NLRP3基因3種常見的單核苷酸多態性(SNP:rs35829419、rs7525979和rs3738448)的基因型和等位基因頻率分布，并分析此位點的多態性是否與痛風的發病相關。

對象與方法

1.研究對象：痛風組(n=290)：本研究中痛風組患者均來源于2018年1月～2020年12月在新疆醫科大學第四附屬醫院各門診就診病例和住院的漢族男性病例。已按照國際風濕病協會(2015年)分類標準確診為痛風，并且所有的痛風病例均為漢族男性，患者平均年齡為48±13歲[12]。健康對照組來源于2018～2020年新疆醫科大學第四附屬醫院門診和體檢中心的健康體檢者302例，平均年齡為45±11歲，受試者均為漢族男性，無全身性炎癥病史并排除關節炎史，無糖尿病、腎病、高血壓、血脂異常和心臟病等病史，并事先征得每位患者的書面知情同意書，本研究得到新疆維吾爾自治區中醫醫院醫學倫理學審查委員會的批準。

2.DNA提取：過夜禁食后，在研究對象知情同意的情況下采集研究對象的空腹外周靜脈血樣5ml，將2ml血樣收集在進行過抗凝處理的乙二胺四乙酸(EDTA)試管中，使用DNA提取試劑盒從血液樣本中提取DNA,并在-80℃下保存直至使用，剩余的3ml離心后進行生化檢測。

3.NLRP3基因位點SNP分型(rs35829419、rs7525979、rs3738448)：采用上海天昊生物科技有限公司的SNPscanTM分型試劑盒對592個樣本3個SNP位點進行基因位點分型，采用連接酶連接反應(ligase chain reaction,LCR)的高特異性對SNP位點基因型和等位基因進行識別，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列以及通過連接酶加接反應獲得位點對應的不同長度連接產物，利用標記熒光的通用引物對連接產物進行PCR擴增，通過熒光毛細管電泳對擴增產物進行電泳分離，最后經過對電泳圖譜的分析獲取各個SNP位點的基因型。

4.生化指標實驗室檢查：取空腹靜脈血3ml，使用日立7600全自動生化分析儀測量尿酸(SUA)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖(FBG)、高密度脂蛋白(HLD)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(Cr)、血清葡萄糖(GLU)等，所有的檢測均在新疆醫科大學第四附屬醫院檢驗科進行。

5.統計學方法：用Epidata軟件對問卷資進行錄入，使用SPSS 20.00統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料組間比較采用t檢驗。計數資料組間比較用χ2檢驗，采用單因素Logistic回歸分析計算比值比(OR)和95%置信區間(CI)評估NLRP3基因多態性與痛風性關節炎風險因素之間的關聯。用SHEsis在線軟件對每個SNP進行Hardy-Weinberg平衡性檢驗(HWE)，計算兩組基因頻率和等位基因頻率及評估病例組和對照組的基因型和等位基因比例是否達到群體遺傳平衡。

結 果

1.臨床生化指標的分析:痛風組血糖、尿酸、膽固醇、高密度脂蛋白、肌酐水平均明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、甘油三酯比較，差異均無統計學意義(P>0.05),詳見表1。

表1 兩組一般資料與生化指標比較

2.痛風發病相關的危險因素分析:將吸煙、飲酒、高血壓、高血糖、肥胖、TG、TC和尿酸8個因素作為自變量引入回歸分析發現吸煙、血糖和尿酸與痛風發病相關(P<0.05)，詳見表2。

表2 痛風發病相關危險因素的 Logistic 回歸分析結果

3.基因SNP的Hardy-Weinberg平衡性檢驗：對兩組研究對象rs35829419、rs7525979和rs3738448這3個位點進行Hardy-Weinberg平衡性檢驗，分析結果顯示，本研究對照組群體達到遺傳平衡，具有群體代表性(P>0.05)，詳見表3。

表3 NLRP3基因的Hardy-Weinberg平衡性檢驗

4.基因頻率及等位基因頻率分布情況比較：痛風組與對照組NLRP3基因rs35829419、rs7525979和rs3738448位點SNP位點基因型及等位基因頻率分布比較，rs35829419、rs3738448位點基因型及等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，不能說明這2個位點對痛風的發生產生作用。rs7525979基因型及等位基因頻率分布比較，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表4。

表4 痛風組與對照組NLRP3基因型及等位基因頻率分布的比較[n(%)]

5.NLRP3 基因SNP位點連鎖不平衡檢驗與單倍型分析:NLRP3的3個SNP位點之間連鎖不平衡檢驗結果顯示，rs7525979-rs3738448 處于LD(D′>0.8和r2>0.3被認為是顯著LD)。對這3個SNP位點進行單倍型分析結果顯示，常見的單體型為CCG、CCT和CTT占所有研究個體中觀察到的單體型的99.5%。與HC受試者比較，GA病例中單倍型CTT的頻率顯著降低(P<0.05)，而CCT單倍型的頻率顯著增加(P<0.05)。攜帶CTT單倍型的個體發生GA的風險顯著增加(OR=52.961，P<0.05)，而CTT單倍型是發生痛風的保護因素(OR=0.227，P<0.05),詳見表5。

表5 NLRP3基因單倍型的分布及遺傳風險的關系[n(%)]

結 果

國內外的流行病學研究資料均表明，痛風的患病率呈逐年升高趨勢，并且與脂代謝紊亂、肥胖、糖尿病及心血管系統疾病等密切相關[13]。高嘌呤飲食如攝入過多海產品、動物內臟等或飲酒均能增加痛風的發生率[14]。本研究結果顯示，對照組尿酸、膽固醇、高密度脂蛋白、肌酐水平與痛風組比較，差異有統計學意義，吸煙、血糖和高尿酸與痛風發病相關。通過NCBI數據庫查找發現，人類的NLRP3基因位于1q44染色體上,由11個外顯子組成，SNP位點共有1000多個。NLRP3炎性小體在痛風發作中通過IL-1β介導的炎癥發生和擴增起關鍵的作用。作為痛風炎癥發作時激活IL-1β的開關，MSU晶體通過活化NLRP3炎性小體，激活效應蛋白胱冬肽酶-1(caspase-1)，進而將無活性的白細胞介素-1前體(pro-IL-1β)剪切加工為成熟的IL-1β，從而引起炎性反應[15]。

研究顯示，NALP3炎性體與阿爾茨海默病、腎臟疾病、痛風等非感染性炎癥疾病有關[16]。一項針對中國人群開展的研究報告顯示，NLRP3的rs10754558和rs10925019位點促進潰瘍性結腸炎的發展[17]。研究發現，rs7525979位點位于核苷酸寡聚結構域，其多態性與美國羅克維爾市人群帕金森病有關[18]。本課題組前期的研究結果發現，rs10754558位點與痛風發病有一定的關聯[19]。因此，筆者假設NALP3炎性小體中的功能性SNP可能參與原發性痛風的發生。

本研究以290例漢族男性痛風患者和302例健康體檢者為研究對象，選取3個SNP位點進行分析，發現3個SNP位點中rs7525979CC基因型和C等位基因在痛風組的分布頻率高于對照組，兩組分布比較差異有統計學意義(P<0.05)。痛風組rs7525979-C等位基因的頻率為95%，對照組為81.45%，差異有統計學意義(P=0.000)，提示C等位基因可能是痛風發病的危險等位基因。痛風組rs7525979-T等位基因的頻率顯著低于對照組，T等位基因可能是痛風發病的保護基因。痛風組攜帶rs7525979-CC基因型的頻率高于對照組(P=0.000)，攜帶CC基因型的個體發生痛風的風險顯著高于攜帶TT基因型的個體。rs35829419與rs3738448基因型和等位基因頻率在痛風和對照組分布頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05),不能說明這兩個位點與痛風有關聯。

進一步對rs35829419、rs3738448、rs7525979這3個位單倍型分析發現3個位點可形成ATT、CCG、CTT、CTG、CTT、ACG和ACT 7種單倍型，CCT單倍型痛風組的頻率高于對照組(P<0.05)，而CTT單倍型痛風組的頻率顯著低于健康組(P<0.05)，攜帶CTT單倍型的個體發生痛風的風險較其他單倍型增加(OR=52.961)，而攜帶CCT單倍型的個體發生痛風的風險降低(OR=0.227)，CCT單倍型對痛風發生有保護作用。

綜上所述，NLRP3基因rs7525979位點的基因多態性與痛風發病有關聯，但是NLRP3基因rs35829419、rs3738448與痛風之間未發現關聯。NLRP3炎性受體基因多態性位點與痛風是否有關聯需要開展進一步的臨床和遺傳學研究，為將來在人群中進行早期發現、早期預防、開展臨床基因治療工作和基因芯片等方面的工作提供重要依據。