阿利吉侖對大鼠急性肝衰竭的保護作用及機制研究

李曉青 陳云茹 張 曦 葉 峰 藺淑梅 李建州

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是在無慢性肝病基礎上短時間內發生大量肝細胞壞死及嚴重肝功能損害，進展迅速，病死率高，目前尚缺乏特效治療藥物[1]。研究發現，人體內的腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)和肝臟局部RAS的激活與脂肪肝、慢性肝炎和肝硬化密切相關，為肝臟疾病的治療提供了新的思路，但關于RAS在肝衰竭中的研究報道甚少[2,3]。阿利吉侖是第2代腎素抑制劑，能夠直接降低腎素的活性，減少血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)生成，在第一環節阻斷RAS系統[4]。因此推測阿利吉侖可以通過阻斷RAS對急性肝衰竭發揮保護作用。本研究通過D-GalN/LPS聯合注射誘導大鼠急性肝衰竭模型，采用阿利吉侖進行干預，探討阿利吉侖對急性肝衰竭的保護作用及其分子機制。

材料與方法

1.實驗動物及主要試劑：體質量180～200g的清潔級雄性8周齡SD大鼠，由西安交通大學醫學院動物中心提供，本研究在西安交通大學醫學院生物醫學倫理學委員會審批后實施(倫理許可證編號：2017-606)。D-GalN與LPS購自美國Sigma-Aldrich公司。阿利吉侖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。AngⅡ、血管緊張素(1-7)[angiotensin1-7，Ang(1-7)]、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。RNA提取試劑、熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)、葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)一抗購自艾博抗(上海)貿易有限公司，二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。

2.實驗分組：將30只清潔級健康SD大鼠按隨機數字表法分為3組：①正常對照組：10只，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，30min后再次注射等量0.9%氯化鈉注射液；②肝衰竭組：10只，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，30min后腹腔注射D-GalN(0.8g/kg)/LPS(10μg/kg)；③阿利吉侖組：10只，腹腔注射阿利吉侖(25mg/kg)，30min后腹腔注射D-GalN(0.8g/kg)/LPS(20μg/kg)。所有實驗大鼠10h后統一處死，采血分離血清，同時留取肝臟右葉組織，凍存備檢。

3.生化指標及炎性細胞因子的檢測：采用全自動生化分析儀(型號：Rayto Chemray 240)檢測大鼠血清中的ALT、AST、LDH、ALP水平。按照試劑盒說明書采用Elisa法檢測大鼠血清或肝組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、AngⅡ、Ang(1-7)水平。

4.HE染色：獲取大鼠肝臟右葉組織后放入10%甲醛溶液中固定72h，經組織脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、切片脫蠟、蘇木精染色、伊紅染色等常規步驟，200倍光鏡下觀察肝臟病理變化并拍照。

5.TUNEL法檢測肝臟細胞凋亡：采用TUNEL法檢測大鼠肝右葉組織中肝細胞凋亡指數。在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，與細胞核重疊且呈紅色熒光的為陽性細胞。運用凋亡指數表示，選取5個400倍鏡下視野，每個高倍視野計數100個細胞，計數各視野的凋亡指數。凋亡指數(%)=各視野陽性細胞數/100×100%，每個大鼠的凋亡指數等于各視野凋亡指數的平均值。

6.熒光定量PCR分析：每組隨機選擇5只大鼠的肝右葉組織進行檢測，采用Trizol法提取肝臟組織的總RNA，反轉錄成cDNA，應用ABI 7500熒光定量PCR儀進行反應，數據以2-△△Ct進行分析。β-actin上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴增條帶為240bp。GRP78上游引物：5′-ACGACCCCTGACAAAAGACA-3′，下游引物：5′-GTCAGGCGGTTTTGGTCATT-3′，擴增條帶為195bp。CHOP上游引物：5′-CCCCAGGAAACGAAGAGGAA-3′，下游引物：5′-CGCACTGACCACTCTGTTTC-3′，擴增條帶為210bp。

7.Western blot法檢測：每組隨機選擇5只大鼠的肝右葉組織進行檢測，用裂解液提取肝臟組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取50μg樣本進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的封閉液室溫搖床封閉2h。PVDF膜浸泡于封閉液稀釋的一抗中4℃孵育過夜。TBST洗膜后，PVDF膜浸泡于封閉液稀釋的二抗37℃搖床孵2h。TBST洗膜后用ECL液顯色檢測蛋白信號。用BandScan圖像軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，分別計算GRP78、CHOP與內參β-actin的灰度值之比作為其相對含量值。

結 果

1.3組大鼠RAS關鍵分子的變化：與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠血清和肝臟組織的AngⅡ水平均明顯升高，肝臟組織的Ang(1-7)水平明顯下降，而AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯升高(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠血清和肝臟組織的AngⅡ水平均明顯下降，Ang(1-7)水平明顯升高，而AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯下降(P=0.000)，詳見表1和表2。

表1 3組大鼠血清中RAS關鍵分子的變化

表2 3組大鼠肝組織中RAS關鍵分子的變化

2.3組大鼠生化指標的變化：與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠血清的ALT、AST、LDH、ALP水平明顯升高(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠血清的ALT、AST、LDH、ALP水平明顯下降(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 3組大鼠生化指標的變化A.3組大鼠血清ALT的變化；B.3組大鼠血清AST的變化；C.3組大鼠血清LDH的變化；D.3組大鼠血清ALP的變化。*P<0.05，**P=0.000

3.3組大鼠炎性細胞因子濃度的變化：與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β1水平明顯升高(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β1水平明顯下降(P=0.000)，詳見圖2。

圖2 3組大鼠炎性細胞因子濃度的變化A.3組大鼠血清TNF-α的變化；B.3組大鼠血清IL-6的變化；C.3組大鼠血清TGF-β1的變化。*P<0.01，**P=0.000

4.3組大鼠肝組織病理的變化：在200倍光鏡視野下可見，與正常對照組比較，肝衰竭大鼠的肝臟組織HE染色后可見部分肝小葉結構紊亂，肝竇淤血，大量肝細胞變性壞死及炎性細胞浸潤。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組仍可見炎性細胞浸潤和肝竇淤血，但肝細胞的變性壞死明顯減少，肝實質細胞數量明顯增多，詳見圖3。

圖3 3組大鼠肝臟組織HE染色(×200)A.正常對照組；B.肝衰竭組；C.阿利吉侖組

5.3組大鼠肝組織細胞凋亡的變化：在200倍熒光視野下可見，與正常對照組比較，肝衰竭大鼠的肝臟組織出現大量細胞核染成紅色熒光的凋亡細胞，而阿利吉侖組大鼠肝臟組織內凋亡細胞數量較肝衰竭組明顯減少，詳見圖4。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠肝臟組織中肝細胞的凋亡指數明顯下降(P=0.000)，詳見表3。

表3 3組大鼠肝組織凋亡指數的比較

圖4 3組大鼠肝臟組織TUNEL染色(×200)A.正常對照組；B.肝衰竭組；C.阿利吉侖組

6.3組大鼠肝臟組織GRP78、CHOP表達水平的變化：熒光定量PCR分析結果顯示，與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠肝臟組織中GRP78、CHOP的 mRNA表達水平明顯上調(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組肝臟組織中GRP78、CHOP的 mRNA表達水平明顯下調(P=0.000)，詳見圖5中A和B。Western blot法檢測結果顯示，3組大鼠肝臟組織中GRP78、CHOP蛋白的水平與mRNA的表達水平趨勢一致(P=0.000)，詳見圖5中C～E。

圖5 3組大鼠肝組織GRP78、CHOP表達水平的變化A.3組大鼠肝組織GRP78 mRNA水平的變化；B.3組大鼠肝組織CHOP mRNA水平的變化；C.3組大鼠肝組織GRP78蛋白水平的變化；D.3組大鼠肝組織CHOP蛋白水平的變化；E.3組大鼠肝組織Western blot法檢測結果。*P=0.000

討 論

RAS系統是人體內重要的內分泌系統，其發揮生物學作用主要通過兩條功能軸，即血管緊張素轉換酶-血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin converting enzyme- angiotensinⅡ-angiotensinⅡ type1 receptor，ACE-AngⅡ-AT1R)軸和血管緊張素轉換酶2-血管緊張素(1-7)- Mas受體[angiotensin converting enzyme2- angiotensin1-7- mas receptor，ACE2- Ang(1-7)-MasR]軸。既往研究表明，ACE-AngⅡ-AT1R軸參與調控多種炎癥相關的病理過程，主要發揮促炎、促氧化應激及促凋亡等負面效應[5～9]。而ACE2-Ang(1-7)-MasR軸作為拮抗軸，則發揮抗炎、抗氧化應激及抗凋亡化等正面效應[10,11]。RAS已被證實參與肝炎、肝纖維化等多種肝臟疾病的病理過程，但在肝衰竭中的具體作用機制尚不清楚[12,13]。本研究發現，在急性肝衰竭進程中，RAS的核心效應分子AngⅡ和Ang(1-7)呈現相反的變化趨勢，AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯升高，提示存在ACE-AngⅡ-AT1R軸過度激活。而阿利吉侖干預可以顯著降低ACE-AngⅡ-AT1R軸的激活水平，同時提高ACE2- Ang(1-7)-MasR軸的激活水平，從而糾正兩條功能軸失平衡狀態，發揮其保護作用。

炎癥和凋亡是急性肝衰竭進展中肝臟的特征性病理改變[14]。本研究發現，LPS/D-GalN誘導的急性肝衰竭大鼠在10h后即出現嚴重的肝功能損傷和炎性細胞因子風暴，表現為血清中ALT、AST、ALP、LDH等生化指標以及TNF-α、IL-6、TGF-β1等經典炎性細胞因子水平的顯著升高，同時組織中可見大量肝細胞變性壞死和凋亡肝細胞。而在造模前給予阿利吉侖干預，則可以明顯減輕急性肝衰竭大鼠的肝功能損傷和炎性細胞因子風暴，同時組織中肝細胞變性壞死、凋亡明顯減少。以上研究結果表明，腎素抑制劑阿利吉侖能夠通過阻斷RAS發揮抗炎、抗凋亡效應，對急性肝衰竭具有保護作用。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)與各種急性或慢性的肝臟疾病的發生和發展密切相關，包括非酒精性脂肪肝、藥物性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等[15～18]。已有研究證實，在急性肝衰竭進程中，存在嚴重的ERS，而抑制ERS可以減輕急性肝衰竭動物的肝功能損傷[19]。本研究發現，阿利吉侖干預后肝衰竭大鼠肝臟組織中ERS標志分子GRP78 和CHOP的表達水平明顯下調，提示阿利吉侖可能通過抑制內質網應激發揮保護作用。但是，在急性肝衰竭進程中RAS與ERS相互作用的分子機制仍有待于更深一步的研究。

綜上所述，阿利吉侖通過阻斷RAS，能夠明顯減輕急性肝衰竭進程中的肝臟炎癥，減少肝細胞的凋亡，其保護作用可能與抑制內質網應激有關。因此，阻斷RAS可能為急性肝衰竭的治療提供新的思路。