從調節Cajal細胞自噬探討芍藥甘草湯改善Oddi括約肌功能障礙的機制

李甫 陳萌 吉建梅 張晞文 丁俊 黃金鑫 唐睿 蔡淦

摘要 基于芍藥甘草湯具有顯著改善Oddi括約肌功能障礙（SOD）患者腹痛的臨床療效和抑制自噬相關蛋白（GPR78、Beclin1）的工作基礎，結合Cajal間質細胞（ICC）過度自噬將引起平滑肌收縮紊亂、進一步導致SOD的研究進展，探討芍藥甘草湯調節ICC自噬水平及治療SOD的分子藥理機制。首先，復制豚鼠SOD模型，觀察芍藥甘草湯對Oddi括約肌壓力、ICC自噬水平的影響;其次，嗎啡刺激誘導離體SOD模型，觀察芍藥甘草湯對Oddi括約肌肌條收縮曲線、自噬通路的影響;最后，分離原代ICC、構建IRE1基因沉默或過表達載體、衣霉素刺激ICC建立內質網應激模型，予不同濃度的芍藥甘草湯孵育，觀察ICC內質網應激水平、自噬信號通路的變化。最終驗證“芍藥甘草湯抑制IRE1/Beclin1信號通路，減輕ICC內質網應激引起的過度自噬，從而改善SOD平滑肌舒張效應”的科學假說，為推進中醫藥調節膽道動力學的理論研究夯實基礎。

關鍵詞 芍藥甘草湯;Oddi括約肌功能障礙;Cajal間質細胞;細胞自噬;IRE1/Beclin1通路

Study on the Mechanism of Shaoyao Gancao Decoction on Improving Sphincter Dysfunction

of Oddi by Regulating Autophagy of Interstitial Cells of Cajal

LI Fu， Chen Meng， JI Jianmei， ZHANG Xiwen， DING Jun， HUANG Jinxin， TANG Rui， CAI Gan

（Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

Abstract Based on the clinical effect of Shaoyao Gancao Decoction on abdominal pain of Sphincter of Oddi dysfunction （SOD） patients and the work basis of inhibiting autophagy related proteins （GPR78，Beclin1）， combined with the research progress that Cajal interstitial cells （ICC） over autophagy will cause smooth muscle contraction disorder and further lead to SOD research development， to explore the molecular pharmacological mechanism of Shaoyao Gancao Decoction on regulating the level of ICC autophagy and treating SOD. Firstly， the SOD model of guinea pig was duplicated， and the effects of Shaoyao Gancao Decoction on Oddi sphincter pressure and ICC autophagy level was observed; secondly， morphine stimulation induced SOD model in vitro， and the effects of Shaoyao Gancao Decoction on Oddi sphincter contraction curve and autophagy signal pathway of Oddi was observed; finally， we isolated the primary ICC， constructed the silencing or overexpression vector of IRE1 gene， and stimulated ICC by tunicamycin to establish the endoplasmic reticulum stress model， and incubated with different concentrations of Shaoyao Gancao Decoction to observe the changes of endoplasmic reticulum stress level and autophagy signal pathway in ICC. We verified the scientific hypothesis that Shaoyao Gancao Decoction can inhibit IRE1 / Beclin1 signal pathway， reduce excessive autophagy caused by ICC endoplasmic reticulum stress， so as to improve the relaxation effect of SOD smooth muscle， which will lay a solid foundation for the theoretical research of TCM regulating biliary dynamics.

Keywords Shaoyao Gancao Decoction; Oddi Sphincter dysfunction; Interstitial cells of Cajal; Cell Autophagy; IRE1/Beclin1 pathway

中圖分類號：R259文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.025

Oddi括約肌（Sphincter of Oddi，SO）是膽、胰與十二指腸連接部位的精密平滑肌裝置，在神經、體液、局部反射的多重復雜調控下，形成時相性的移行復合運動（MMC），發揮控制膽汁和胰液排放、防止反流的“門戶”作用[1]。Oddi括約肌功能障礙（Sphincter of Oddi Dysfunction，SOD）是因SO舒張功能異常引起的一組疾病，臨床分為膽型和胰型2種，以膽型SOD常見，主要表現為上腹部疼痛發作30 min以上、足以影響日常活動甚至到急診科就診，排便或改變體位、服用抗酸藥均不能緩解，可伴隨惡心、嘔吐、肝功能異常、膽管擴張、膽管排空時間延長等表現[2]（羅馬Ⅳ標準，2106）。SOD往往沒有器質性改變證據、卻會給患者帶來持久難忍的困擾，嚴重時可繼發肝損、胰酶異常、甚至急性胰腺炎等，嚴重危害患者的生命健康[3]。因此，積極探索SOD的病理機制和藥物治療具有重要意義。

目前針對SOD的首選治療仍然是內鏡下括約肌切開術（Endoscopic Sphincterotomy，EST），但EST僅對部分患者有效、且近期有并發出血和胰腺炎風險，手術引起SO永久性破壞可導致菌群易位、反流性膽管炎的后果[4]。內鏡下局部注射內毒毒素對SOD療效亦不確切[5]。內科保守治療如鈣通道拮抗劑、硝酸酯類、胃腸動力調節藥物等可能臨時減緩SO平滑肌痙攣，但實際療效沒有在足夠大的RCT研究中得到證實[6]。

事實上，SOD的形成涉及不同細胞-組織-器官間的功能失調，多種細胞信號傳導、基因或蛋白表達異常均可導致SO平滑肌舒縮功能紊亂。這提示我們，SOD病理機制復雜，細胞與細胞之間、細胞因子及其信號通路之間存在復雜聯系，基于單一靶點的治療方法對SOD效果欠佳。為此，我們從調控平滑肌細胞的Cajal間質細胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）入手，分析芍藥甘草湯如何通過下調IRE1/Beclin1通路抑制ICC過度自噬，以促進ICC功能而改善SOD的作用機制。

1 恢復和促進ICC功能可能是治療SOD的重要途徑

慢波電位是消化道平滑肌特有的、細胞自發性節律性去極化形成的起步電變化，本身不能直接引起平滑肌收縮，但它是動作電位產生的基礎。研究證明，ICC是消化道慢波電位的發生器，作為起搏細胞發揮著調控平滑肌動力、推進電活動傳播、介導和調節神經遞質的重要作用[7-8]。

ICC廣泛存在于人和哺乳動物的消化系統中，最初發現在胃、小腸、結腸等部位的平滑肌層內以網絡狀廣泛分布，因其與固有神經和平滑肌細胞之間的緊密連接，引起廣泛關注[9];深入研究發現，在胃腸道以外的膽囊、肝外膽道、Oddi括約肌、輸精管、膀胱、尿道中均有ICC的分布[10]。解剖學和電生理學研究均證明ICC是神經元細胞和平滑肌細胞的重要紐帶，依靠特異性縫隙連接蛋白Cx43和Cx45將神經細胞和平滑肌細胞緊密結合[11]。盡管ICC細胞總量不足消化道肌膜細胞的10%，卻承擔著調控平滑肌基本電節律起搏和傳播的關鍵角色[12];如果說Oddi括約肌對于人類的膽汁和胰液排放是起“閥門”作用[1]，那么ICC可謂是開啟閥門的“鑰匙”。

ICC特異性表達一種酪氨酸激酶受體c-kit，可被干細胞生長因子（Stem Cell Factor，SCF）激活。SCF由胃腸神經細胞及平滑肌細胞合成并分泌，作為c-kit的天然配體，可促進c-kit受體的表達。當c-kit與SCF結合后信號跨膜傳遞，一方面激活PI3K/Akt、RAS/ERK、JAK/STAT3種胞內信號途徑，發揮調控ICC增殖分化及維持細胞表型的功能[13];另一方面，c-kit/SCF還能磷酸化ICC細胞膜表面SP、NK1、TRPV1等受體，增加ICC內在起搏節律，調節SO平滑肌的收縮[14]。此外，ICC與平滑肌細胞均來源于同一種前體細胞，c-kit受體的表達與否決定該前體細胞的分化方向，即當c-kit/SCF信號系統受損時，則該前體細胞因缺少c-kit受體刺激而分化為平滑肌細胞[15]，如此則ICC數量和功能缺失，最終導致SO網絡結構發生改變，影響慢波的形成及信號的傳導，導致消化道動力障礙[16]。由此可見，c-kit/SCF表達對ICC的生長發育和維持SO動力的穩態具有至關重要的作用。

越來越多的研究發現，在肝外膽管、膽囊、Oddi括約肌等組織中存在c-kit表達陽性細胞，即ICC;而在多種膽道疾病如膽囊膽固醇結石、慢性膽囊炎、硬化性膽管炎、膽管囊腫等引發的SOD中，ICC的活性與功能隨著疾病的進展而明顯下降，并同時伴有SCF表達降低[17-20]。我們前期通過建立比格犬膽囊切除模型，發現腸神經系統中最重要的抑制性神經遞質一氧化氮（Nitric Oxide，NO）可以對犬SO產生顯著抑制作用[21-22]。事實上，NO發揮抑制作用的主要靶細胞就是ICC，以激活ICC內可溶性環磷酸鳥苷（Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP）及cGMP依賴性蛋白激酶的方式，調節ICC內鈣離子濃度及周圍平滑肌細胞的收縮活動[23]。我們進一步在透射電鏡下觀察，發現模型組的SO組織內ICC細胞數量和細胞器減少、線粒體部分空泡狀或雙層膜結構消失。因此，恢復并促進ICC的數量和功能可能是防治SOD的重要途徑之一。圍繞這些問題，明確SOD形成過程中對ICC起到負向調節作用而促進SO舒張異常的關鍵因素，不僅可以提高ICC細胞活性及增強周圍平滑肌細胞的舒張效應，更為我們進一步治療SOD提供新的思路。

2 阻斷IRE1/Beclin1信號通路可減少ICC過度自噬、提高SO舒張效應

ICC在消化道中形成網狀結構，其數量處于動態平衡之中，炎性反應、手術應激、激素水平改變等病理因素均可導致ICC數量減少或功能減退，發生多種消化動力障礙性疾病[8，12]。其中，內質網應激（ERS）引起細胞過度自噬是ICC數量減少和結構破壞的重要原因[24]。

ERS引起的細胞自噬是一把“雙刃劍”：外界刺激引起內質網穩態改變，導致未折疊蛋白反應（UPR）或細胞內Ca2+超載，都將激活自噬反應，即通過胞內溶酶體途徑消化自身受損的細胞器或錯誤折疊蛋白，從而減輕細胞損傷、維持細胞正常生理功能，可起到預防疾病的作用;然而ERS持續存在和增強的情況下，如機體受到外界電離輻射、缺血缺氧、驚厥等，過度自噬將引導細胞走向程序性死亡[25-26]，使得機體病變加重。

已有文獻表明，IRE1-TRAF2-JNK-Beclin1是ERS啟動細胞過度自噬的重要信號通路：ERS時，未折疊或錯誤折疊蛋白的大量積累，使內質網分子伴侶葡萄糖調節蛋白78（GRP78）與肌醇依賴性激酶-1（IRE1）解離，參與UPR反應，GRP78被作為ERS發生的標志性分子[25]。過多的錯誤折疊蛋白，將激活自噬清除受損的內質網，當自噬發生時，微管相關蛋白輕鏈3B（LC3B）始終位于自噬體膜上，被作為檢測自噬水平的特異性方法。IRE1是內質網I型跨膜蛋白，ERS時啟動二聚化的IRE1，其Ser/Thr蛋白激酶結構域與腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）相互作用形成復合物，將信號傳遞至凋亡信號調控激酶I（ASK1），繼而激活c-Jun氨基端激酶（JNK），活化的JNK調節磷酸化的Bcl2釋放出游離的Beclin1進而誘導自噬。Beclin1是一種含BH3結構域的Bcl2互作蛋白，作為自噬基因，是自噬的直接執行者[27-28]。

多項研究在消化動力障礙疾病中證實了ICC數量或功能異常可能與ERS引發的ICC過度自噬有關：在功能性消化不良的大鼠模型中，ICC-MY內細胞結構出現異常，線粒體腫脹明顯，粗面內質網顆粒脫落，可見大量自噬泡[29];在慢傳輸型便秘的大鼠模型中發現，腸道ICC中ERS標記分子GRP78、自噬相關Beclin1和LC3B表達上升、自噬泡水平較對照組明顯增高[30]。然而，并未在SOD疾病模型中找到ICC產生ERS繼而引發自噬的證據。據此，我們猜測，ERS引起細胞過度自噬是否是SOD中ICC數量減少和結構破壞的罪魁禍首？

針對我們的猜測，我們觀察了比格犬膽囊切除模型中SO壓力明顯異常的對象，通過透射電鏡檢查SO平滑肌中ICC超微結構，發現ICC與周圍平滑肌和神經末梢之間縫隙連接減少，細胞器減少，粗面內質網擴張且脫顆粒明顯，自噬泡可見。同時我們在嗎啡刺激模擬豚鼠SOD模型中以RT-PCR檢測SO標本內ERS自噬相關基因，發現GRP78、Beclin1表達較假手術組明顯升高，而相反的，c-kit和SCF表達則明顯下降。見圖1。這提示我們：ERS誘導的ICC過度自噬可能參與了SOD的發病過程，并影響到了SO內ICC的數量和功能;ERS激活IRE1/Beclin1信號通路促進細胞過度自噬可能是導致ICC數量功能減退并引起SO動力障礙性疾病的重要機制。因此，尋找針對ICC具有靶向調節的藥物，可以減緩內質網應激-自噬引起的細胞程序性死亡，增強膽道動力障礙病理狀態下ICC的數量和功能，可能成為治療SOD藥物研究的新方向。

3 探討芍藥甘草湯調節ICC活性的機制為治療SOD提供了新視角

SOD以腹痛為主要臨床表現，古代沒有SOD的病名，但類似的癥狀表現在“腹痛”等病證中，中醫學認為其主要以少陽膽經或厥陰肝經病變為主。肝藏血，血為陰，故肝體為陰;肝主疏泄，內寄相火，為風木之臟，易動風化火，故肝之功能屬陽。《臨證指南醫案·肝風》：“故肝為風木之臟，因有相火內寄，體陰用陽，其性剛，主動主升，全賴腎水以涵之，血液以濡之”。筋膜喜陽氣之溫煦、陰血之榮養，陰陽不足或陰陽失衡則筋脈橫解、攣急而痛。因此，治療當以柔肝舒筋、緩急止痛為主。芍藥甘草湯最早見于漢代張仲景所著《傷寒論·辨太陽病脈證并治》，為張仲景治療諸痛的基礎方，亦是緩急止痛的常用藥對，僅《傷寒論》113方中就有24方使用了這一配伍。盡管僅有兩味藥，實則有“四兩撥千斤”之效。方中芍藥為君，偏于入里而瀉實，甘草為臣，偏于補中滋液。兩者配伍，張弛有道、柔肝緩急，具有柔肝舒筋、緩急止痛之功效，可糾正“體陰用陽”失衡所致的筋膜拘攣[31]。

現代藥理研究發現，芍藥中主要成分芍藥甙可通過降低SO基礎壓發揮治療膽源性胰腺炎的作用[32]，并對高膽固醇血癥模型的SO肌環產生舒張作用[33];甘草的甲醇提取物FM100亦可鎮痛、抑制消化液分泌、減輕平滑肌痙攣[32]。

課題組針對本科室16例臨床診斷為Ⅱ型SOD的患者，采用自身前后對照發現芍藥甘草湯可以明顯降低VAS疼痛評分、ALT/AST、γ-GT以及ECT肝膽核素顯像的膽汁排泄時間;通過4～7個月的隨訪，最終僅2例（12.5%）患者行內鏡下EST術。我們同時在預實驗中發現，芍藥甘草湯可顯著降低嗎啡誘導SOD模型豚鼠Oddi括約肌內自噬相關GRP78、Beclin1基因表達，并提高了c-kit與SCF表達。見圖1。以上結果提示我們，調控內質網應激-自噬相關IRE1-Beclin1信號通路，提高ICC數量活性，可能是芍藥甘草湯改善SO平滑肌舒張效應的重要機制之一。

4 科學假說和主要研究內容

基于ICC在消化動力障礙疾病中的新進展和芍藥甘草湯具有舒張SO效應的工作基礎，我們提出科學假說：芍藥甘草湯抑制IRE1/Beclin1信號通路，減輕ICC內質網應激引起的過度自噬，從而改善SOD平滑肌舒張效應。

為了驗證上述假說，開展以下研究工作：復制豚鼠SOD模型，設IRE1抑制劑和c-kit特異性抑制劑為對照，予芍藥甘草湯干預治療，觀察芍藥甘草湯對Oddi括約肌壓力、ICC胞內內質網應激水平、ICC自噬水平的影響，闡明芍藥甘草湯在體內抑制ICC過度自噬而改善SOD的作用;分離正常豚鼠的Oddi括約肌肌環，嗎啡刺激誘導離體SOD模型，并同時予不同濃度的芍藥甘草湯加入肌槽中孵育，觀察芍藥甘草湯對Oddi括約肌肌條收縮曲線、ICC自噬水平的影響;分離正常豚鼠Oddi括約肌內原代ICC，構建IRE1基因沉默或過表達載體，轉染至ICC，并予衣霉素刺激ICC建立內質網應激模型，予不同濃度的芍藥甘草湯孵育，觀察ICC內質網應激水平、自噬水平及IRE1/Beclin1信號通路的變化，解析芍藥甘草湯下調IRE1/Beclin1信號通路抑制ICC過度自噬的作用機制。見圖2。

通過本研究，將驗證以上科學假說，闡明芍藥甘草湯改善SOD的作用機制，促進中醫藥調節膽道動力學的研究發展。

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（2020-03-17收稿 責任編輯：王明）

基金項目：國家自然科學基金項目（81904017）;上海市科委“科技創新行動計劃”臨床醫學領域項目（19401972400）;上海市浦東新區衛生和計劃生育委員會衛生行業科研專項（PW2018E-03）

作者簡介：李甫（1985.06—），男，碩士研究生，主治醫師，研究方向：膽道動力學的中西醫結合研究，E-mail：yclifu17@163.com

通信作者：蔡淦（1938.08—），男，本科，主任醫師，研究方向：脾胃病的中西醫結合研究，E-mail：lwchenmeng@163.com