帕托珠利混懸液對靶動物仔豬的安全性評價

王震，許琴瑟，張偉，高嫣珺，聶雅，霍皓遠，肖文華，卜仕金*

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇農牧科技職業學院,江蘇 泰州 225300)

帕托珠利又名托曲珠利砜，是托曲珠利的一種主要活性代謝產物[1]，不僅具有抗球蟲活性，而且對新孢子蟲、弓形蟲、鞭毛蟲等原蟲也均顯示出良好的活性[2]。德國拜爾公司已率先將該活性成分開發用于治療馬原蟲性腦脊髓炎(EPM)，并于2001年獲美國FDA批準上市[3-4]。鑒于托曲珠利在控制仔豬球蟲病方面的成功應用，近期湖北龍翔藥業科技股份有限公司研制出一種5%帕托珠利混懸液新制劑，擬用于預防仔豬球蟲病。前期臨床藥效試驗表明，5%帕托珠利口服混懸液按15～20 mg/kg單次口服給藥，對仔豬球蟲病有良好的防治效果，藥效與20 mg/kg托曲珠利溶液相當[5]。本試驗旨在進一步評價帕托珠利混懸液對靶動物—哺乳期仔豬用藥的安全性，該研究不僅對指導臨床合理用藥具有重要參考價值，而且是申報新獸藥時必需提供的一項研究資料。

1 材料與方法

1.1 供試藥品

5%帕托珠利口服混懸液(批號20180501)，由湖北龍翔藥業科技股份有限公司提供。

1.2 儀器

貝克曼Unicel Dxc800 synchron型全自動生化分析儀、Sysmex XE-2100型全自動血液分析儀、CX2型OLYMPUS顯微鏡、JA2003型電子天平。

1.3 受試動物及飼養管理

32只3～5日齡健康蘇姜仔豬，公母各半，由江蘇畜牧現代科技園國家級姜曲海豬保種場提供。試驗前采用耳號及豬舍號進行識別標記。受試仔豬選自4窩母豬。仔豬跟隨母豬分別安置在不同的產床，場所符合分娩母豬要求。仔豬可以自由吮。房間自然通風。仔豬在保溫箱中休息，通過電熱板加熱取暖，溫度保持在25～32 ℃。房間溫度保持在18～25 ℃，濕度保持在30%～70%。自然采光，每天采光時間不低于10 h。

1.4 分組及給藥

采用分層區組隨機化方法，將32只3～5日齡仔豬隨機分為4組，每組8只，公母各半[6]。采取多劑量水平給藥，給藥劑量分別為0、1、3、5倍最大推薦劑量。具體分組及給藥如表1。

1.5 給藥途徑及給藥時間

口服給藥，口服時將藥物置于試驗仔豬舌根處讓其自然吞咽。共給藥3次，每次間隔3 d。于最后1次(第9天)給藥結束繼續觀察1周。

1.6 試驗期間臨床觀察

給藥前后觀察并記錄受試動物的臨床體征，給藥后6 h每小時觀察一次，之后在8、12、24 h分別進行觀察，了解是否有嘔吐或其他異常情況。平時上、下午各1次，觀察內容包括但不限于皮膚、被毛、眼睛及分泌物、外觀、口腔分泌物、口腔黏膜、哺乳行為、糞便性狀、呼吸情況和行為等是否有異常。

表1 試驗分組及給藥

1.7 增重和體溫變化

于給藥前第0、5、10、16天逐只進行體溫測量和稱重。

1.8 血常規和血液生化檢測

所有受試仔豬分別在第3次給藥結束后及觀察期結束后24 h內，于前腔靜脈采集血樣。血樣一分為二，其中一份裝入有抗凝劑的試管進行血常規分析，另一份裝入無抗凝劑試管，析出血清后進行血液生化檢查。其中血常規檢測包括紅細胞總數(RBC)、白細胞總數(WBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板總數(PLT)、紅細胞壓積(HCT)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)等參數，血液生化檢測包括總膽紅素(TBIL)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白/球比(A/G)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)、血糖(GLU)、鈉、鉀、鈣、磷等參數。

1.9 病理檢查

試驗結束后，對所有存活的仔豬進行撲殺，進行大體組織病理學檢查，如有疑似與藥物相關的肉眼可見的異常損傷，則采集該異常組織供進一步組織病理學檢查。對未見明顯異常病變的組織則采集新鮮組織和主要臟器，對采集的組織樣品用10%福爾馬林固定保存，以供進一步組織病理學檢查[7]。

1.10 數據處理

采用SPSS統計學軟件進行顯著性檢驗。各組數據以“平均值±標準差”表示。采用方差分析對各組間增重、血液生理生化等指標進行分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 臨床表現

試驗期間，空白對照組和各劑量試驗組動物均無死亡。對照組中4406號仔豬精神略差，被毛粗糙，搶奶困難；3倍劑量組中4105號仔豬精神稍差，皮膚干燥，被毛粗糙，搶奶困難。除此外，其他受試動物精神狀態均良好，給藥后未出現嘔吐現象，吮乳行為及排便等均正常。

2.2 增重與體溫變化

各劑量組體重變化見表2，體溫變化見表3。在完整的試驗期間內，數據表明1倍劑量組、3倍劑量組相5倍劑量組增重稍大于空白組，但各劑量組之間無顯著差異(P>0.05)。試驗結束后測得各試驗組體溫低于初始體溫，但保持總體穩定。表明5%帕托珠利混懸液對仔豬生長無抑制作用，對仔豬生長不會產生不利影響。

表2 帕托珠利混懸液對仔豬生長性能的影響(n=8)

表3 帕托珠利混懸液對仔豬體溫的影響(n=8) ℃

2.3 血常規及血液生化參數檢測結果

在最后一次給藥結束后及觀察期結束后各組仔豬的血常規及血清生化測定結果分別見表4～7。

表4 第3次給藥結束后各組仔豬血常規參數測定結果(n=8)

統計分析顯示：在最后一次給藥結束后，血常規與對照組相比，1倍劑量組嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞計數差異顯著(P<0.05)；3倍劑量組嗜中性粒細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白、紅細胞壓積差異顯著(P<0.05)；5倍劑量組嗜中性粒細胞差異顯著(P<0.05)，其他無顯著性差異。血清生化測定結果與對照組相比，1倍劑量組球蛋白、ALT、肌酐和鈣離子差異顯著(P<0.05)，3倍劑量組、5倍劑量組ALT、肌酐差異顯著(P<0.05)。在觀察期結束后各組血清生化及血常規參數均無顯著性差異(P>0.05)，且處于正常范圍內，表明帕托珠利混懸液在5倍最大推薦劑量下對仔豬的血常規和血清生化指標無影響。

表5 第3次給藥結束后各組仔豬血液生化參數測定結果(n=8)

表6 觀察期結束后各組仔豬血常規參數測定結果(n=8)

表7 觀察期結束后各組仔豬血液生化參數測定結果(n=8)

2.4 病理學變化

試驗結束后處死各組所有存活仔豬并進行尸檢，均未見明顯眼觀病變。對5倍劑量組和對照組仔豬剖檢進行組織病理學檢查均未見明顯異常病變：心肌細胞排列整齊且間隙正常，無充血及炎性細胞出現(圖1)；肝細胞(圖2)、脾細胞(圖3)形態完整，肺泡大小正常且無炎性細胞出現(圖4)；腎小球、腎小囊、腎小管管腔正常(圖5)。此外，十二指腸和空腸皺壁及腸絨毛形態正常，無脫落萎縮等情況，腸黏膜下層可見腸腺；淋巴結中皮質及髓質細胞形態結構正常，淋巴竇未見充血現象(圖片略)。

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

A. 對照組;B. 5倍劑量組

3 討論

靶動物安全性研究其實是一種毒性研究，其目標是證明在推薦的應用條件下藥品對靶動物的安全性、與這種藥物的毒性相關的癥狀和影響，以及如果5倍的最大推薦劑量水平或更少對靶動物具有毒性，則毒性研究應證明這種藥品對動物健康或生產無明顯不良反應的最大劑量水平。靶動物安全性試驗通過臨床癥狀觀察、組織病理學觀察、血常規指標和血液生化指標來發現尚處在開發階段的新獸藥，過量和延長用藥時間是否會導致與藥物有關的不良反應，從而確定該藥的安全范圍[8]。

本試驗中，試驗期間所有仔豬均存活，僅對照組和3倍劑量組中各有一頭仔豬因搶奶困難，增重較差外，其他受試動物的精神狀況均良好，哺乳行為、排便均無異常。所有仔豬給藥期間均未出現嘔吐反應。第3次給藥結束后，與空白對照組相比，1倍劑量組的平均嗜酸性粒細胞含量較高；1倍、3倍、5倍劑量組的平均嗜中性粒細胞含量均有不同程度升高；3倍劑量組紅細胞含量、血紅蛋白含量以及紅細胞壓積偏低。由于新生仔豬尚處于哺乳階段，各項血液參數不穩定[9]，因此沒有證據表明與給藥劑量存在相關性。在觀察期結束后，各劑量組的平均血常規參數間均無明顯差異。

肌酐是肌肉在體內的代謝產物，主要經腎小球濾過排出體外。肌酐正常指標為44～133 μmol/L，過高的肌酸含量表示腎臟出現損傷，腎功能不全。給藥后血液生化參數顯示，與空白對照組相比較，各受試藥物組的肌酸水平均稍有升高，但腎臟組織病理學檢查均未見異常，表明帕托珠利對腎臟無影響。

谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶主要分布于肝細胞中，肝細胞有炎癥、壞死、中毒等造成肝細胞損傷時，便會釋放入血，使轉氨酶上升[9]。試驗結束后各劑量組血液生化參數與空白對照組相比，無顯著性差異，且均在正常范圍內，綜合肝臟病理切片表明高劑量5%帕托珠利混懸液對仔豬肝臟無損傷。

本試驗中，5%帕托珠利混懸液3次給藥后，1、3、5倍劑量組與空白對照組相比較，血常規、血液生化指標均差異不顯著，各劑量組之間無明顯差異；對照組和5倍劑量組中剖檢仔豬的主要臟器均未發現異常，組織病理學檢查亦未見明顯病理變化。試驗期間未觀察到其他不良事件。研究表明，5%帕托珠利混懸液按推薦劑量使用對仔豬具有較高的安全性。