基因重排檢測技術(shù)聯(lián)合玻璃體液中IL-10和IL-6檢測對PIOL的診斷價(jià)值

呂永川，彭金萍，管英朝，張 陽，張淑清，樹玲博 ，陶 勇

0引言

原發(fā)性眼內(nèi)淋巴瘤(primary intraocular lymphoma, PIOL)是發(fā)生于眼內(nèi)組織的淋巴瘤，屬原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤亞型，本病多見于老年人，以視物模糊、眼前黑影漂浮感為主要臨床表現(xiàn)[1]。PIOL病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，且無標(biāo)準(zhǔn)治療方案，數(shù)據(jù)報(bào)道約80%的患者隨著病情發(fā)展可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)而致死，預(yù)后較差，及時(shí)診斷并開展放射治療、化學(xué)治療等方式是取得生存獲益的關(guān)鍵[2-3]。但PIOL可獲取的標(biāo)本量相對較少，臨床診斷及病理診斷均存在困難。探索有效的PIOL診斷方式至關(guān)重要。淋巴細(xì)胞抗原受體基因重排是淋巴瘤的重要輔助診斷方式之一，但檢測過程復(fù)雜、影響因素繁雜，并在一定程度上影響檢測靈敏度[4]。玻璃體液及房水中細(xì)胞因子檢測也是PIOL的重要輔助診斷方式，有研究指出檢測眼內(nèi)白介素-10(interleukin-6,IL-10)及IL-10/白細(xì)胞-6(interleukin-6,IL-6)比值可輔助診斷B細(xì)胞淋巴瘤[5-6]。鑒于此，本研究擬將基因重排檢測技術(shù)結(jié)合檢測玻璃體液IL-10、IL-6水平用于PIOL的診斷，分析其診斷價(jià)值，以期為PIOL的臨床診斷提供試驗(yàn)依據(jù)。

1對象和方法

1.1對象回顧性分析。研究對象為2015-01/2019-12在本院收治的擬診PIOL患者27例，其中經(jīng)診斷學(xué)玻璃體切割手術(shù)檢查確診PIOL 21例21眼，葡萄膜炎患者6例6眼。PIOL組中男11例，女10例，年齡31～75(中位數(shù)53)歲，均為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。葡萄膜炎組中男4例，女2例，年齡25～69(中位數(shù)51)歲，前葡萄膜炎4例，全葡萄膜炎2例，急性期3例，慢性期3例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)診斷性玻璃體切割術(shù)病理檢查確診；(2)接受過基因重排檢測及玻璃體液中IL-10、IL-6水平，且檢測前未接受過藥物、手術(shù)等治療方式干預(yù)；(3)病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理檢查確診為中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤眼內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤；(2)雙眼病變；(3)全身其他系統(tǒng)性淋巴瘤病變。本研究符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。所有患者知情同意，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑盒基因組DNA提取試劑盒購自根生化科技(北京)有限公司；基因測序平臺為Life Techplogy技術(shù)平臺；Lympho Track Dx IGH FR2 Assay基因重排檢測驗(yàn)證試劑盒、Lympho Track Dx TCRG Assay基因重排檢測驗(yàn)證試劑、IgH、TCRG基因重排檢測試劑盒均購自美國Invivo Scribe公司；酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購自尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有限公司；Spectra Max i3x多功能酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2.2基因重排檢測所有患者均接受玻璃體切割手術(shù)，未灌注時(shí)切除并收集核心玻璃體1.5～2.0mL，指壓方式維持相對穩(wěn)定壓力，獲取標(biāo)本后灌注平衡液維持眼內(nèi)壓，切除剩余玻璃體。取玻璃體標(biāo)本至Eppendorf管，基因組DNA提取試劑盒提取DNA，安捷倫4200評價(jià)所提取DNA質(zhì)量，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體：Master Mix 45μL，AmpliTaq Gold Taq 0.2μL，DNA 5μL，總體積50μL；擴(kuò)增條件：95℃ 7min、95℃ 45s、60℃ 45s、72℃ 90s，循環(huán)數(shù)29個(gè)；72℃ 10min。而后采用AMPure XP方法純化PCR產(chǎn)物，安捷倫4200對DNA進(jìn)行定量。NEXT-flex DNA Barcords及NEXTflex PCR free DNA測序試劑盒構(gòu)建DNA文庫，乳液PCR制備模板，將文庫上載Ion 316芯片，上Ion PGM機(jī)測序，測序結(jié)束后將導(dǎo)出的FASTQ文件直接導(dǎo)入Lympho Track Dx PGM Software Dx軟件完成數(shù)據(jù)分析，將最終結(jié)果導(dǎo)入EXCEL表格；參照文獻(xiàn)[7]對結(jié)果進(jìn)行克隆判定。

1.2.3細(xì)胞因子檢測取0.7～1.0mL玻璃體液至Eppendorf管，15 000r/min條件下離心10min，酶聯(lián)免疫吸附法測定玻璃體液中細(xì)胞因子IL-10(正常范圍0～50.0pg/mL)、IL-6(1.0～50.0pg/mL)水平；Spectra Max M45酶標(biāo)儀測定各孔吸光度，波長450nm，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算玻璃體液中IL-10、IL-6含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用P50(P25，P75)描述，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例或百分比(%)描述；診斷價(jià)值采用受試者工作特征(ROC)曲線分析，ROC曲線下面積比較采用Z檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1上機(jī)測序及測序結(jié)果分析納入PIOL患者21例中，15例IhH FR2單克隆性重排序列，陽性率71%(15/21)，均可獲得基因重排的基因序列；4例檢出TCRG克隆性基因重排序列；其余6例標(biāo)本未能檢出IgH FR2單克隆序列。而6例確診為葡萄膜炎的標(biāo)本中均未見IhH FR2、TCRG單克隆性重排序列，F(xiàn)R2、TCRG均為多克隆性，DNA電泳圖見圖1。經(jīng)ROC曲線分析顯示基因重排檢測PIOL的AUC為0.857(0.669～0.961)，Z=7.071，P<0.001；約登指數(shù)0.714，敏感性、特異性分別為71.43%、100.00%，見圖2。

表2 細(xì)胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析結(jié)果

圖1 組織DNA電泳圖 M：Marker；D1～D7：PIOL組；C1～C3：葡萄膜炎組。

圖2 基因重排檢測PIOL診斷PIOL的ROC曲線分析。

表1 兩組患者細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果 P50(P25，P75)

圖3 細(xì)胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析。

2.3基因重排檢測聯(lián)合細(xì)胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析基因重排檢測陽性、IL-10>170.90pg/mL、IL-10/IL-6比值>1.95中滿足任意條件即判定為PIOL，經(jīng)ROC曲線分析顯示基因重排檢測聯(lián)合細(xì)胞因子診斷PIOL的AUC為0.893(0.713～0.978)，Z=4.553，P<0.001，約登指數(shù)0.785，敏感性、特異性分別為95.24%、83.33%，見圖4。

圖4 基因重排檢測聯(lián)合細(xì)胞因子水平診斷PIOL的ROC曲線分析。

3討論

PIOL屬非霍奇金淋巴瘤，且多數(shù)PIOL為B細(xì)胞來源，約占眼內(nèi)及眼眶腫瘤的0.8/100 000[8]。當(dāng)前國內(nèi)并無PIOL的流行病學(xué)調(diào)查研究，但近年來受診斷技術(shù)提升、免疫缺陷患者增加等多因素影響，PIOL發(fā)病率有上升趨勢[9]。本病臨床表現(xiàn)缺乏特異性，被稱為偽裝綜合征的典型代表，臨床極易將其誤診為葡萄膜炎、鞏膜炎，診斷難度較大[10]。當(dāng)前臨床對擬診PIOL的診斷流程也十分繁雜，一般先行MRI檢查，而后接受腰椎穿刺并行腦脊液檢查，若檢查結(jié)果為陰性則需完善診斷性玻璃體切割術(shù)獲得組織標(biāo)本，若為陽性則診斷為PIOL；若為陰性則需進(jìn)一步接受視網(wǎng)膜下或視網(wǎng)膜病變活檢。同時(shí)，在眼部活檢證實(shí)診斷后還需完善神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)檢查及腦脊液分析，一般PIOL患者的診斷可延遲8～21mo，且研究報(bào)道一般PIOL患者并病理學(xué)檢查確診后一般生存率僅為3～5a[11]。眼底自發(fā)熒光檢查、光學(xué)相干斷層成像等影像學(xué)輔助方式雖能有效評價(jià)疾病進(jìn)程及預(yù)后，但診斷特異性不佳[12]。

研究報(bào)道，多數(shù)淋巴細(xì)胞增生性疾病通過組織形態(tài)學(xué)、免疫表型便可獲得確診，但仍有少部分淋巴瘤在經(jīng)大量免疫標(biāo)志檢測后依然難以鑒別良惡性。基于淋巴瘤的病生理特征，其是因淋巴細(xì)胞成熟阻滯于某個(gè)階段發(fā)生克隆性增生，所有細(xì)胞具有相同的重排方式，即克隆性重排，這也是克隆性增生和譜系來源的標(biāo)志，且自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)/T細(xì)胞淋巴瘤中免疫球蛋白及T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)基因多數(shù)呈胚系構(gòu)型，無克隆基因重排，這也是免疫球蛋白及TCR基因克隆性重排則可作為淋巴瘤的重要輔助診斷方式的重要原因[13-14]。本研究中，15例IhH FR2單克隆性重排序列，陽性率71%(15/21)，均可獲得基因重排的基因序列；4例檢出TCRG克隆性基因重排序列；其余6例標(biāo)本未能檢出IgH FR2單克隆序列。6例確診為葡萄膜炎的標(biāo)本中均未見IhH FR2、TCRG單克隆性重排序列，F(xiàn)R2、TCRG均為多克隆性。經(jīng)ROC曲線分析顯示基因重排檢測技術(shù)診斷PIOL的AUC為0.857，特異性高達(dá)100.00%，但敏感性欠佳，僅為71.43%。往期研究也報(bào)道[15]，IhH FR2單克隆性重排序列也并不意味著惡性，CD陽性T淋巴細(xì)胞增生等疾病也可出現(xiàn)淋巴細(xì)胞克隆性增生，也因PCR的高度敏感性，也可發(fā)生假克隆或寡克隆現(xiàn)象。因此，單純基因重排檢測技術(shù)診斷PIOL存在局限性。

IL-10、IL-6均是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。前者作為重要的多效免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可通過抑制Th1細(xì)胞、INF-γ、IL-2來損害腫瘤免疫監(jiān)視；不僅如此，IL-10還可刺激B淋巴細(xì)胞增殖分化，在淋巴瘤惡性發(fā)展中也扮演重要角色[16]。而IL-6則具多重性及復(fù)雜性，良惡性B淋巴細(xì)胞、良惡性T淋巴細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-6，其參與機(jī)體生理性免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)，當(dāng)前研究已證實(shí)IL-6與淋巴細(xì)胞增生異常具緊密關(guān)聯(lián)，可作為淋巴細(xì)胞生長因子參與非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)發(fā)生及發(fā)展[17]。本研究顯示，PIOL患者玻璃體液中IL-10及IL-10/IL-6水平均顯著高于葡萄膜炎患者，但兩種病變患者IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ROC曲線分析也顯示IL-6對PIOL無顯著診斷效能，可能與腫瘤細(xì)胞、炎癥均可增加IL-6分泌有關(guān)[18-19]。ROC曲線分析還顯示，IL-10診斷PIOL的AUC最高，特異性雖為100.00%，敏感性則僅為66.67%；IL-10/IL-6診斷的AUC略低于IL-10，特異性與IL-10相當(dāng)，敏感性僅為52.40%。由此也可見，單一IL-10、IL-6等細(xì)胞因子檢測作為PIOL的診斷性生物標(biāo)志物存在局限性。進(jìn)一步應(yīng)用基因重排檢測技術(shù)聯(lián)合細(xì)胞因子檢測診斷時(shí)，AUC高達(dá)0.893，敏感性、特異性分別為95.24%、83.33%。提示基因重排檢測技術(shù)聯(lián)合IL-10、IL-6等細(xì)胞因子檢測診斷PIOL可顯著提升診斷敏感性，且特異性良好。

綜上所述，玻璃體液IL-10、IL-10/IL-6可用于PIOL輔助診斷，但診斷敏感性欠佳現(xiàn)象，聯(lián)合應(yīng)用基因重排檢測技術(shù)可明顯提升診斷敏感性，并獲得良好的特異性。考慮PIOL的大樣本研究罕見，本研究樣本量也僅為21例，基因重排檢測技術(shù)，尤其是細(xì)胞因子檢測在PIOL診斷中的應(yīng)用仍有極大深入探究空間，以期在下階段采集充足樣本量后持續(xù)補(bǔ)充及完善。

1莫春艷, 張學(xué)東. 原發(fā)性眼內(nèi)淋巴瘤的診斷及治療. 眼科新進(jìn)展 2017;37(6):597-600