基于DNA條形碼技術(shù)的連云港基巖岸常見帽貝物種識(shí)別

鄭 霞，張夢(mèng)秋，劉 軍

（連云港師范高等專科學(xué)校，連云港市生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222006）

世界海洋物種目錄數(shù)據(jù)庫（World Register of Marine Species，WoRMS）將軟體動(dòng)物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）物種分為10個(gè)亞綱。然而，目前學(xué)術(shù)界對(duì)這些亞綱的分類與該數(shù)據(jù)庫并不完全一致。以其中的亞綱Patellogastropoda為例，該數(shù)據(jù)庫中按“亞綱”來分，而在一些研究中仍按“目”來對(duì)待［1－2］。但較為統(tǒng)一的是，學(xué)術(shù)界將屬于Patellogastropoda的物種統(tǒng)稱為“真帽貝”（true limpets），共包含4個(gè)科，即帽貝科（Patellidae）、花帽貝科（Nacellidae）、笠貝科（Lottiidae）和無鰓笠螺科（Lepetidae）［3］。不屬于Patellogastropoda的其他類似真帽貝形態(tài)的物種則被稱為“假帽貝”［1，4］。

帽貝喜歡附著于堅(jiān)硬的基底，如巖石、貝殼等。該類物種通常具有類似“帽子”或“斗笠”形狀的外殼，其作為腹足綱物種中最原始的種類，具有重要的研究價(jià)值［3］。比如，由于其分布廣泛（廣泛的生存適應(yīng)性），且兼?zhèn)淙拥囊撰@得性，帽貝已成為學(xué)者們研究生物適應(yīng)性進(jìn)化史與生物分布變遷史的重要模型生物［5－7］。

此外，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，沿海地區(qū)環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，世界各國對(duì)此采取了一系列應(yīng)對(duì)措施。其中，海洋環(huán)境污染的生物評(píng)價(jià)法是了解污染水平的有效手段之一［8］。而帽貝因其自身特點(diǎn)已成為重要的污染評(píng)價(jià)指示生物［9］。據(jù)記載，中國沿海分布的真帽貝有26種，其中，中國大陸沿海的真帽貝物種主要分布于山東、浙江、福建沿海［10］。連云港地處中緯度，東臨黃海，具有江蘇省唯一的基巖海岸（長約22 km）［11］，然而，目前連云港地區(qū)帽貝的分布情況尚不清楚［1，12］，因此有必要對(duì)連云港地區(qū)沿岸分布的帽貝種類進(jìn)行研究。由于同一種帽貝在形態(tài)上可能存在較大差異，僅基于形態(tài)特征的識(shí)別具有一定的不確定性。因此，本研究主要利用DNA分子標(biāo)記（細(xì)胞色素c氧化酶I，COⅠ）對(duì)所采集的帽貝進(jìn)行鑒別［13］，以期為連云港沿海帽貝物種的分布研究補(bǔ)充資料，并為今后開展有關(guān)無脊椎動(dòng)物進(jìn)化研究及環(huán)境污染評(píng)價(jià)等工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與統(tǒng)計(jì)

由于江蘇省連云港市的連島東側(cè)為旅游景區(qū)（連島景區(qū)），人為開發(fā)程度較高，而連島西側(cè)基巖岸較為原始，受人為干擾較少，因此本研究以連島西側(cè)基巖岸作為采樣點(diǎn)（圖1）。2016年3月—2019年5月，課題組按4個(gè)季節(jié)（春季：3—5月，夏季：6—8月，秋季：9—11月，冬季：12—2月）分別在連島西側(cè)的基巖岸進(jìn)行了帽貝樣本的采集，每個(gè)季節(jié)采集1～2次。采集過程中，主要采用樣線法，以潮上帶外緣某點(diǎn)為起點(diǎn)，向大海方向呈放射狀樣線采樣。每次采樣均從高潮退潮開始采。用游標(biāo)卡尺測(cè)量帽貝貝殼的長、寬、高。利用python 3.8.3的scipy包進(jìn)行組間形態(tài)特征的差異顯著性檢驗(yàn)（獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)）。

圖1 樣本采集的地理位置Fig.1 Geographical coordinates of sampling site

1.2 DNA提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

帽貝肌肉組織DNA的提取參照經(jīng)典的酚氯仿抽提法［8］。物種識(shí)別中用到的無脊椎動(dòng)物線粒體COⅠ基因的通用引物為：上游引物，5′-TAAA CTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；下游引物，5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′［14］。擴(kuò)增體系設(shè)定為50μL，見表1。

表1 PCR體系配置情況Tab.1 Materials used in PCR

程序設(shè)置為：94℃，30 min；94℃，40 s，72℃，1 min（5個(gè)循環(huán)）；94℃，40 s，46℃，40 s，72℃，1 min（30個(gè)循環(huán)）；72℃，10 min；4℃下儲(chǔ)存。將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 物種識(shí)別

利用世界海洋物種目錄數(shù)據(jù)庫（WoRMS）比對(duì)本實(shí)驗(yàn)采集的全部樣本，并基于帽貝外殼的形狀、顏色、大小，挑取形態(tài)差異較大的樣本進(jìn)行基于DNA條形碼的識(shí)別。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)COⅠ序列進(jìn)行比對(duì)分析（Blast）。在所有比對(duì)到的序列中將相似度≥99%的序列作為目標(biāo)序列，并采集這些序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。系統(tǒng)發(fā)生分析采用NJ法，參數(shù)選擇MEGA軟件的默認(rèn)值［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 帽貝的獲得情況

本研究在3年內(nèi)共采集205份帽貝樣本。基于帽貝的形態(tài)及貝殼顏色將其分為5種類型，分別是X-W-1、X-W-6、X-W-7、X-W-18、X-W-20（圖2）。其中，類型X-W-6的帽貝形態(tài)與其他帽貝差異較大，表現(xiàn)為其貝殼近乎圓形，而其他帽貝都為卵圓形。類型X-W-1的樣本，其貝殼內(nèi)有一圈白色的環(huán)，貝殼邊緣分布有很粗的黑白相間的條紋。X-W-7的樣本僅發(fā)現(xiàn)了2個(gè)，明顯比其他樣本要?。ū?）。X-W-20的樣本貝殼內(nèi)部有明顯的黑色光澤。從采樣情況來看，X-W-20及X-W-1類帽貝較為常見，分別占樣本總數(shù)的52.68%和28.30%；其次是X-W-18類帽貝，占比為16.59%（表2）。由于X-W-6類型與X-W-7類型的帽貝數(shù)量未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的基本要求，因此僅利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)其他3種類型帽貝進(jìn)行了兩兩間的形態(tài)差異顯著性分析，結(jié)果顯示，各類型間均不存在顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

從上述5類帽貝中各選擇1～3個(gè)個(gè)體，均成功提取總DNA。利用通用引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功率均為100%，測(cè)序峰圖單一，擴(kuò)增獲得了650 bp左右的序列（圖3）。

圖3 COⅠ基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Prolife of agarose gel electrophoresis for PCR products of COⅠ

2.3 物種識(shí)別及系統(tǒng)發(fā)生分析

利用COⅠ序列通過數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析（Blast），初步識(shí)別出這些帽貝隸屬于4個(gè)屬，共5個(gè)種，其中4種為“真帽貝”，分別是圓錐擬帽貝（Patelloidaconulus）、史氏背尖貝（Nipponacmeaschrenckii）、齒舌新笠貝（Nipponacmearadula）、笠貝（Lottiagoshimai），1種是“假帽貝”，為日本菊花螺（Siphonariajaponica）（表3）。與以往研究相比，除日本菊花螺與笠貝在連云港海岸未見報(bào)道外，其余3種均已有報(bào)道（表3）［1，12］。本研究結(jié)果為江蘇連云港沿海海域帽貝的物種多樣性提供了新的記錄。

表3 帽貝的COⅠ序列識(shí)別結(jié)果Tab.3 Results of species identification by COⅠbarcoding

基于Blast結(jié)果，利用這5個(gè)種的代表序列（樣品編號(hào)為X-W-1、X-W-6、X-W-7、X-W-18，XW-20），結(jié)合NCBI中25條COⅠ基因序列（每個(gè)種各5條序列），構(gòu)成一個(gè)系統(tǒng)發(fā)生分析數(shù)據(jù)集（圖4），以此進(jìn)一步佐證物種識(shí)別的結(jié)果。從系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系來看，本次識(shí)別的所有“真帽貝”均來自笠貝科，“假帽貝”來自松螺科（Siphonariidae）。Bootstrap計(jì)算結(jié)果顯示，齒舌新笠貝（X-W-6）、笠貝（X-W-1）、日本菊花螺（X-W-20）的識(shí)別有著較高的可信度（圖4）。同時(shí)，本研究基于世界海洋物種目錄數(shù)據(jù)庫還進(jìn)行了圖片檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，X-W-20的外部形態(tài)與該數(shù)據(jù)庫中的日本菊花螺有著較高的相似性（圖1，圖5）。此外，X-W-1的外部形態(tài)與NAKAYAMA等［16］報(bào)道的笠貝具有較高的相似性（圖1，圖5），該物種于2017年首次被日本學(xué)者命名。研究還發(fā)現(xiàn)，X-W-6的外部形態(tài)與SASAKI和OKUTANI［17］報(bào)道的齒舌新笠貝有著較高的相似性（圖1，圖5）。

圖4 基于COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.4 Phylogenic analysis by COⅠgenes

然而，系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果顯示，X-W-7和X-W-18混雜于包含圓錐擬帽貝與史氏背尖貝的支系中（圖4）。對(duì)于此種現(xiàn)象，本研究比較了X-W-7、XW-18與數(shù)據(jù)庫中的史氏背尖貝。通過圖片比較發(fā)現(xiàn)，這二者在形態(tài)上與數(shù)據(jù)庫中的史氏背尖貝差異都較大（圖1，圖5），基本上可排除樣本XW-7和X-W-18為史氏背尖貝的可能性。結(jié)果支持這兩種類型的帽貝樣本更可能是圓錐擬帽貝。

圖5 WoRMS及文獻(xiàn)中的帽貝參考圖Fig.5 Limpet photos from WoRMSand references

3 討論

以往基于帽貝貝殼形態(tài)的物種識(shí)別，存在的主要問題是貝殼形態(tài)易受到不同生境及年齡差異的影響，從而增加了識(shí)別工作的難度［3］。本研究比較了不同種帽貝間貝殼的長、寬、高指標(biāo)，結(jié)果顯示，利用帽貝的此類形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行物種識(shí)別具有較大的局限性（組間無顯著性差異，P＞0.05）。近期，類似研究也提示了相似的現(xiàn)象，比如，中國沿海的同一種的13個(gè)矮擬帽貝（Patelloidapygmaea）地理群體間的長、寬、高指標(biāo)已具有一定程度的差異（部分地理群體的這些指標(biāo)均值間甚至有2～3倍的差異）［18］。因此，僅利用這些形態(tài)指標(biāo)區(qū)別不同物種，得到的結(jié)果并不一定準(zhǔn)確。

本研究統(tǒng)計(jì)樣本數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，日本菊花螺為優(yōu)勢(shì)種，而齒舌新笠貝的數(shù)量較少（僅3個(gè)），其原因除了與影響其種群變動(dòng)的因素有關(guān)以外［19］，還可能與其生境的特征有關(guān)。據(jù)觀察，本次研究中齒舌新笠貝附著在潮濕、陰暗的石縫中，增加了樣本獲取的難度。ITSUKUSHIMA等［20］也曾報(bào)道過齒舌新笠貝的生境喜好，認(rèn)為該物種偏向于沙質(zhì)的生境。這種生境特征可能是導(dǎo)致該物種在本次實(shí)驗(yàn)中獲得量較少的主要原因之一。當(dāng)然，這還需要在后期的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，雖然潮間帶環(huán)境特殊，但帽貝物種已表現(xiàn)出了很好的適應(yīng)性。溫度常被認(rèn)為是影響物種地理分布范圍邊界的重要環(huán)境變量，而海洋潮間帶物種由于有著近乎線性的地理分布模式，已成為生物地理學(xué)研究的模式生物［21］。本次實(shí)驗(yàn)的主要目的為識(shí)別帽貝物種，今后還可進(jìn)一步開展帽貝分布情況受溫度因素影響的研究，并設(shè)計(jì)更具有針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)方案。

目前，DNA條形碼已被越來越多地用于獲取未經(jīng)種類鑒定生物的分類學(xué)信息［22］。該技術(shù)涉及到對(duì)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因的一個(gè)短片段進(jìn)行測(cè)序，即從分類學(xué)上尚未鑒定種類的標(biāo)本中提取DNA條形碼，并與已知分類的DNA條形碼庫進(jìn)行比對(duì)。形態(tài)鑒定結(jié)合分子生物學(xué)手段能增加物種識(shí)別的準(zhǔn)確性。如今，已被用于物種識(shí)別的線粒體基因技術(shù)還有12／16S rRNA和Cytb基因等［23］。線粒體16SrRNA序列在帽貝物種識(shí)別及種間關(guān)系的研究中都有廣泛的應(yīng)用［15］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證X-W-7和X-W-18并非史氏背尖貝，本研究通過擴(kuò)增這兩個(gè)樣本的線粒體16S rRNA序列后發(fā)現(xiàn)，序列相似度最高的前3條序列均為圓錐擬帽貝，且相似度均為96%①源自本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)。由于擬帽貝屬內(nèi)同一物種的形態(tài)和生態(tài)類型本身差異較大，因此完全基于形態(tài)來識(shí)別該屬內(nèi)的近源種具有一定的難度［15］。圓錐擬帽貝為矮擬帽貝的近源種，其殼高相對(duì)其他的擬帽貝屬物種要高，形狀近錐形［15］。圓錐擬帽貝和P.heroldi都曾被看作矮擬帽貝的同種異名［15，17］，NAKANO和OZAWA［15］利用COⅠ與16SrRNA分子工具成功將這3個(gè)種分離。因此，本研究利用16SrRNA得到的補(bǔ)充識(shí)別結(jié)果具有一定的可靠性。綜合來看，基本可以斷定X-W-7和X-W-18都應(yīng)為圓錐擬帽貝。

4 小結(jié)

本研究借助DNA條形碼以及帽貝物種形態(tài)特征的對(duì)比，成功識(shí)別出了4種帽貝（日本菊花螺、笠貝、齒舌新笠貝、圓錐擬帽貝）。其中，物種日本菊花螺與笠貝為江蘇連云港沿海首次報(bào)道種。研究結(jié)果為了解連云港地區(qū)帽貝多樣性提供了必要的資料。由于樣本采集具有一定的難度（天氣、潮汐、生境等因素都會(huì)影響采樣結(jié)果），導(dǎo)致本次研究存在一定的不足之處。比如本應(yīng)該采集到的矮擬帽貝卻未被采到［18］。連云港基巖海岸帽貝物種的多樣性及分布情況仍有必要進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查。

致謝：感謝參與實(shí)驗(yàn)調(diào)查的蘇麗、魏媛媛、李凡、王井之等同學(xué)。