二氧化鈦納米管及其作為溶栓藥物載體的研究

陳熔熔, 景春蘭, 趙玲玲, 梁洪澤

二氧化鈦納米管及其作為溶栓藥物載體的研究

陳熔熔, 景春蘭, 趙玲玲*, 梁洪澤

（寧波大學(xué) 材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 寧波 315211）

為改善直接使用溶栓蛋白藥物尿激酶(uPA)時容易形成全身性纖維原蛋白分解和大出血的問題, 設(shè)計并制備了負載溶栓藥物的二氧化鈦納米管支架. 采用陽極氧化法合成排列整齊有序的二氧化鈦納米管陣列, 該納米管可負載溶栓藥物uPA, 通過酰胺鍵將殼聚糖(CS)連接到二氧化鈦納米管陣列上, 可對納米管進行封端, 得到uPA緩控釋放的溶栓支架Ti-TNTs-uPA-CS. 用掃描電子顯微鏡、紅外光譜等方法對Ti-TNTs-uPA-CS的形貌和結(jié)構(gòu)進行表征, 并模擬人體生理環(huán)境進行體外溶栓實驗. 與空白組對比后的結(jié)果表明, Ti-TNTs-uPA-CS具有良好的溶栓效果, 并隨著溶栓時間積累, 溶栓效果顯現(xiàn), 說明該溶栓支架對血栓的治療具有積極意義.

二氧化鈦納米管; 藥物載體; 尿激酶; 溶栓

血管血栓的形成是繼發(fā)性心肌梗死、中風、肺栓塞以及其他血管阻塞的禍根. 尿激酶作為常用溶栓藥物, 其通過激活蛋白纖溶酶原為纖溶酶, 進而發(fā)揮溶栓作用, 然而這類藥物具有全身性副作用, 注射后易形成全身性纖維原蛋白分解和大出血[1-2]. 因此, 將藥物載入支架材料中, 當血栓形成時, 可定點靶向緩慢釋放藥物, 不僅能達到治療效果, 還可以緩解藥物的副作用. 以鈦片作為基底, 垂直有序排列的二氧化鈦納米管陣列(TNTs)作為醫(yī)用載體和支架, 具有高表面積, 耐腐蝕性, 優(yōu)異的載藥能力, 良好的生物相容性, 目前已經(jīng)被認為是藥物輸送體系中有前途的載體[3]. 雖然二氧化鈦納米管有其獨特的優(yōu)勢, 但納米管間的黏附性差, 易于從鈦基底剝離, 使得二氧化鈦納米管陣列的應(yīng)用受到極大影響. 為了提高二氧化鈦納米管陣列對基底的黏附性, 研究人員做出了很大的努力. 例如, Schmuki等[4-5]用乙炔處理將TNTs轉(zhuǎn)化為半金屬形式, 以增加二氧化鈦納米管微觀結(jié)構(gòu)中的碳來提高其機械強度. Xiong等[6]在空氣中退火二氧化鈦納米管, 得到二氧化鈦納米管的黏附性隨退火時間而改善的研究結(jié)果. 通過這些方法改善TNTs黏合度的效果還是有限, 因而亟需一種方法能夠有效增加TNTs的黏附性.

為增加二氧化鈦納米管對基底的黏附性, 可以從其形成過程來了解, 并提出改善方案. 眾所周知, 二氧化鈦納米管可以通過電化學(xué)陽極氧化的方法形成[7], 其電解液一般為含氟的電解液. 早在1979年, Kelly課題組研究了氟化物對鈦氧化的影響, 發(fā)現(xiàn)低濃度氟化物可以促進多孔氧化物的形成[8]. 由此我們逐漸意識到, 在電解液中加入少量氟離子是形成二氧化鈦納米管的關(guān)鍵. 另一方面, 電解液中氟化物亦會影響陽極氧化過程, 這是因為氟化物會形成[TiF6]2-水溶性物質(zhì). [TiF6]2-會從兩處產(chǎn)生, 一處是在氧化物-電解質(zhì)界面上的Ti4+發(fā)生復(fù)合: Ti4++6F-→[TiF6]2-, 另一處是由陽極氧化得到的TiO2化學(xué)侵蝕而成: TiO2+6F-+4H+→[TiF6]2-+ 2H2O[9]. 所形成含有氟化物的TiO2層簡稱為FRL (Fluoride-rich TiO2Layer), FRL的存在被認為是界面之間黏附性差的主要原因. 因而, 消除FRL是提高TNTs黏附性的有效方法.

本文以分別含H3PO4和氟化銨的兩種乙二醇電解液進行陽極氧化純鈦片, 制備具有良好黏附性的二氧化鈦納米管陣列. 以該納米管陣列為載體, 負載溶栓藥物尿激酶(uPA), 然后以殼聚糖為封端劑, 通過酰胺鍵結(jié)合到TiO2納米管以改善其生物相容性, 制備尿激酶載體支架材料Ti-TNTs- uPA-CS. 在不同pH下, Ti-TNTs-uPA-CS能緩慢釋放出uPA藥物, 并顯現(xiàn)出良好的溶栓效果.

1 實驗部分

1.1 原料

乙二醇(EG), 上海麥克林生化科技有限公司, 體積分數(shù)>99%; 氟化銨(NH4F), 上海麥克林生化科技有限公司, 質(zhì)量分數(shù)≥99.99%; 磷酸(H3PO4), 上海麥克林生化科技有限公司, AR, 質(zhì)量分數(shù)≥85%; 鈦片, 北京翠鉑林有色金屬技術(shù)開發(fā)中心有限公司; 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl), Sigma Aldrich(St. Louis, US); N-羥基琥珀酰亞胺(NHS), 衢州新騰化學(xué)有限公司; 嗎啉乙磺酸(MES), Sigma Aldrich, 質(zhì)量分數(shù)≥99.5%; 殼聚糖(CS), 寧波市海鑫生物科技有限公司友情提供; 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酮, 國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 尿激酶(uPA), 麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司.

1.2 二氧化鈦納米管陣列(TNTs)的制備

采用陽極氧化法制備二氧化鈦納米管. 具體實驗步驟為: 將切割成3cm×3cm的鈦片機械拋光, 在丙酮中超聲清洗15min. 然后在含NH4F的乙二醇溶液中以60V的電解電壓將鈦片電化學(xué)陽極氧化30min, 通過超聲除去表面氧化物; 再將鈦片在含H3PO4的乙二醇溶液中以相同電壓氧化3～4 min, 并用去離子水沖洗; 第3次在含NH4F的乙二醇溶液中氧化1h, 再用去離子水沖洗; 最后在含H3PO4的乙二醇溶液反應(yīng)3～5min, 并用去離子水沖洗. 將制得的二氧化鈦納米管樣品在空氣中以2℃·min-1程序升溫至450℃, 煅燒3h, 得到的樣品為煅燒后的二氧化鈦納米管.

1.3 殼聚糖(CS)修飾TNTs

CS修飾TNTs的制備參考文獻[10]方法, 并進行了適當?shù)恼{(diào)整, 具體步驟如下: 將EDC·HCl (20 mmol, 0.0383g), NHS(50mmol 0.0575g)溶于10 mL 0.1mmol·mL-1MES(pH 6.0)中, 混合攪拌均勻, 然后加入殼聚糖(1.0g), 使殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為100mg·mL-1, 攪拌6h形成溶液; 將TNTs放入殼聚糖溶液中, 室溫持續(xù)均勻震蕩16h. 取出鈦片, 用MES溶液沖洗, 再用去離子水沖洗, 得到樣品Ti-TNTs-CS.

1.4 Ti-TNTs-CS負載uPA

將修飾過的鈦片(TNTs-CS)裁剪成1cm×1cm, 加入uPA(5mg·mL-1)溶液, 在25℃搖床下避光緩慢震蕩48h, 將載完藥物的鈦片凍干, 于-20℃下保存. 由uPA的上清液標準曲線測出, 在1cm× 1cm的鈦片上, 載有1.4mg FITC-uPA.

1.5 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 掃描電子顯微鏡(SEM)

掃描電鏡(SEM)表征: 將煅燒前后的二氧化鈦納米管分別裁成小片, 黏在導(dǎo)電膠上, 真空鍍金后, 用Hitachi S-4300場發(fā)射掃描電鏡在15kV加速電壓下觀察二氧化鈦納米管樣品的微觀結(jié)構(gòu)和尺寸.

1.5.2 紅外光譜(FTIR)

采用Micro-FTIR顯微紅外光譜儀(美國安捷倫科技(中國)有限公司)對Ti-TNTs和Ti-TNTs-CS樣品進行分析.

1.6 體外溶栓實驗

2 結(jié)果與討論

2.1 陽極氧化合成TNTs

通過SEM電鏡表征二氧化鈦納米管在煅燒前后的形貌特征, 如圖1所示, 上下圖形分別為煅燒前和高溫煅燒后的二氧化鈦納米管. 由圖可見, 經(jīng)450℃高溫煅燒后, 其表面結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生較大的變化, 且TNTs管之間依然保持整齊有序的排列, 從左圖中可以看出, 制備出的二氧化鈦納米管排列密集, 其管內(nèi)徑平均在(70±10)nm, 厚度在7μm左右; 并且可以觀察到Ti與TNTs之間形成了致密的氧化物層(ACOL, Additional Compact Oxide Layer), 由于這層致密氧化物層的存在, Ti與TNTs的黏附性大大提高. 圖2進一步證實, TNTs在翻折下, 其納米管膜沒有剝落現(xiàn)象. 從右圖中可以明顯觀察到二氧化鈦納米管的內(nèi)壁增厚, 并且管內(nèi)徑約保持40nm不變. 并且在使用H3PO4乙二醇電解液陽極氧化鈦片的過程中, 對二氧化鈦納米管的表面結(jié)構(gòu)影響不大, 仍保持多孔結(jié)構(gòu).

圖1 煅燒前后TNTs的SEM圖

圖2 TNTs圖

2.2 紅外分析(FTIR)

如圖3所示, 紅外光譜圖上TNTs中的TiO2的譜帶在400～700cm-1之間, 645cm-1處歸屬于二氧化鈦的特征峰, 即TNTs中Ti-O的伸縮振動峰. TNTs-CCS中2926cm-1處為殼聚糖的C—H伸縮振動峰, 1645cm-1和1553cm-1處分別是仲酰胺I帶中C O的伸縮振動峰和仲酰胺中II帶中N—H的彎曲振動峰, 通過CS上的氨基和羧基形成酰胺鍵, 結(jié)果表明CS成功修飾到TNTs上.

圖3 TNTs和TNTs-CCS的紅外譜圖

2.3 Ti-TNTs-uPA-CS載藥及體外溶栓實驗

如圖4所示, 通過溶栓實驗考察Ti-TNTs-CCS- uPA在不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液中以及不同溶栓時間的體外溶栓效果, 并以磷酸鹽緩沖溶液作為對照. 結(jié)果表明, 在本工作實驗條件下, 經(jīng)過4h, Ti-TNTs-uPA-CS緩慢釋放出尿激酶, 具有一定溶栓效果, 且隨著溶栓時間的增長, 溶栓效果顯著增加. 當溶栓時間達到17h時, Ti-TNTs-uPA-CS+pBS 6.8組溶栓率為41.87%, 而Ti-TNTs-uPA-CS+pBS 7.4組溶栓率為52.67%, 整體來看, 不同pH的緩沖溶液下, Ti-TNTs-uPA-CS的溶栓效果差異不大. 該實驗表明, 將尿激酶成功載入鈦片后, 依舊能保持良好的溶栓能力, 為我們進一步的靶向研究提供了一定基礎(chǔ).

與pBS空白組相比(*P＜0.05, n=3), Ti-TNTs-uPA-CS在不同pH下, 不同時間下對空白組的相對生物活性, 相對于pH 6.8和pH 7.4下生物活性進行標準化.

3 結(jié)論

本工作以鈦片為基底, 通過電化學(xué)陽極氧化法制備二氧化鈦納米管陣列, 殼聚糖作為封端修飾TNTs, 制備溶栓藥物載體材料. 用H3PO4乙二醇作為電解液制備二氧化鈦納米管陣列, 可生成致密的氧化層, 增加納米管陣列與鈦基底的黏附性, 使其不易從鈦片上剝落. 合成的TNTs高度有序, 排列整齊，且煅燒后的TNTs結(jié)構(gòu)依然保持不變. 通過紅外證實殼聚糖成功修飾到TNTs上. 經(jīng)搖床緩慢振蕩, 溶栓藥物uPA成功載入到Ti-TNTs上, 每片1cm×1cm的Ti-TNTs-CS載有1.4mg uPA. 體外溶栓實驗表明, Ti-TNTs-uPA-CCS具有良好溶栓能力, 為我們進一步靶向溶栓治療提供了研究基礎(chǔ), 在治療血栓領(lǐng)域具有應(yīng)用前景.

[1] Vaidya B, Nayak M K, Dash D, et al. Development and characterization of site specific target sensitive liposomes for the delivery of thrombolytic agents[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2011, 403(1/2):254-261.

[2] Sakuragawa N, Shimizu K, Kondo K, et al. Studies on the effect of PEG-modified urokinase on coagulation-fibrino- lysis using beagles[J]. Thrombosis Research, 1986, 41(5): 627-635.

[3] Losic D, Simovic S. Self-ordered nanopore and nanotube platforms for drug delivery applications[J]. Expert Opinion on Drug Delivery, 2009, 6(12):1363-1381.

[4] Schmidt S F, Thiemann S, Berger S, et al. Mechanical properties of anatase and semi-metallic TiO2nanotubes [J]. Acta Materialia, 2010, 58(19):6317-6323.

[5] Hahn R, Schmidt S F, Salonen J, et al. Semimetallic TiO2Nanotubes[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2009, 48(39):7236-7239.

[6] Xiong J Y, Wang X J, Li Y C, et al. Interfacial chemistry and adhesion between titanium dioxide nanotube layers and titanium substrates[J]. The Journal of Physical Chemistry C, 2011, 115(11):4768-4772.

[7] Masuda H, Fukuda K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina[J]. Science, 1995, 268(5216):1466- 1468.

[8] Kelly J J. The influence of fluoride ions on the passive dissolution of titanium[J]. Electrochimica Acta, 1979, 24 (12):1273-1282.

[9] Roy P, Berger S, Schmuki P. TiO2nanotubes: Synthesis and applications[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50(13):2904-2939.

[10] Shi Z L, Neoh K G, Kang E T, et al. Surface functionalization of titanium with carboxymethyl chitosan and immobilized bone morphogenetic protein-2 for enhanced osseointegration[J]. Biomacromolecules, 2009, 10(6):1603-1611.

Preparation of TiO2nanotubes and their application as carriers for thrombolytic drugs

CHEN Rongrong, JING Chunlan, ZHAO Lingling*, LIANG Hongze

( School of Material Science and Chemical Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211, China )

In order to solve the problems of direct use of urokinase (uPA) (e.g. the risk of breakdown systemic fibrinogen and bleeding) and improve the thrombolytic effect, TiO2nanotube arrays were designed and prepared as thrombolytic drug scaffold. The TiO2nanotube arrays were synthesized by anodized electrochemical method. The thrombolytic drug uPA could be encapsulated into the TiO2nanotube arrays, and chitosan (CS) was used as capping agent to combine in the tubes through amide bonds. The morphology and structure of Ti-TNTs-uPA-CS were proved by scanning electron microscopy and infrared spectroscopy. In vitro thrombolytic experiments were performed to simulate human physiological environment. The results showed that Ti-TNTs-uPA-CS produced good thrombolytic ability, compared to PBS control group. It indicates the potential promise of the TiO2nanotube arrays for uPA encapsulation and thrombus treatment.

TiO2nanotubes;drug carrier; uPA;thrombolysis

TQ937

A

1001-5132（2021）04-0097-04

2019?12?23.

寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）網(wǎng)址: http://journallg.nbu.edu.cn/

國家自然科學(xué)基金（51403108）; 寧波市自然科學(xué)基金（2018A610243）.

陳熔熔（1994－）, 女，浙江寧波人, 在讀碩士研究生, 主要研究方向: 生物醫(yī)用材料. E-mail: 1021769525@qq.com

趙玲玲（1986－）, 女, 湖南會同人，副教授, 主要研究方向: 生物醫(yī)用材料. E-mail: zhaolingling@nbu.edu.cn

（責任編輯 章踐立）