miR-373靶向調控同源異型盒基因B3表達影響子宮內膜癌Ishikawa細胞生物學特性的實驗研究

周訓璽，彭敏，賀曉琪，孫國強

越來越多的研究顯示，異常表達的微小RNA（microRNA，miRNA，miR）可通過影響腫瘤細胞的生物學行為參與子宮內膜癌細胞的發生發展。miR-373是miR-371-372-373家族成員，定位于人19q13.42染色體上，在皮膚鱗狀細胞癌和非小細胞肺癌等腫瘤中常見異常表達，且可通過影響細胞生物學功能在腫瘤惡性進展中發揮著癌基因或抑癌基因的作用。同源異型盒基因B3（HOXB3）是同源異型盒基因（HOX基因）家族成員，被證實在結直腸癌和胰腺癌等腫瘤中異常表達，通過影響細胞增殖、遷移和凋亡等參與腫瘤的發生發展。miR-373在子宮內膜癌組織中異常高表達，與腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移等緊密相關，且對癌細胞增殖、侵襲和遷移具有促進作用；然而，miR-373影響子宮內膜癌生物學行為的作用機制并不完全清楚。HOXB3被證實在子宮內膜癌組織中低表達，發揮抑癌作用。本研究通過生物信息學軟件預測發現miR-373與HOXB3 3’非編碼區（Untranslated Region，UTR）存在互補結合位點，猜測miR-373可能通過靶向HOXB3調控子宮內膜癌發生發展。因此，本研究從2018年2月至2019年6月，開展體外細胞實驗旨在觀察miR-373通過靶向調控HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、侵襲和凋亡的調控作用，以期為子宮內膜癌的發病機制和治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人子宮內膜癌細胞株Ishikawa（上海復祥生物公司），胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素雙抗、脂質體2000和Trizol試劑（美國Invitrogen公司），HOXB3抗體（美國Abcam公司），miR-373抑制劑（inhibitor）及抑制劑陰性對照（inhibitor-NC）（上海吉瑪公司），HOXB3 siRNA及其陰性對照NC siRNA（美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司），psiCHECK2熒光素酶載體（西安賽拓博泰生物公司）。逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（大連Takara公司）。Transwell小室（美國Corning公司），膜聯蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），細胞計數（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒（上海碧云天公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、分組和轉染

采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的洛斯維公園紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）-1640培養基在濕度飽和、37℃、5%二氧化碳常規條件的二氧化碳細胞培養箱中培養Ishikawa細胞。實驗分為inhibitor-NC組（轉染inhibitor-NC）、miR-373 inhibitor組（轉染miR-373 inhibitor）、miR-373 inhibitor+siNC組（共轉染miR-373 inhibitor和NC siRNA）和miR-373 inhibitor+siHOXB3組（共轉染miR-373 inhibitor和HOXB3 siRNA），每組設置3個復孔。將對數生長期的Ishikawa細胞以10個/孔接種至6孔細胞板上，待細胞匯合達70%時，根據實驗分組參照脂質體2000說明書將miR-373 inhibitor、inhibitor-NC、NCsiRNA和HOXB3 siRNA轉染至Ishikawa細胞中。轉染6 h后更換培養基，繼續培養48h后收集各組細胞進行后續實驗。

1.2.2 miR-373和HOXB3靶向關系驗證

采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-373和HOXB3的靶向關系。將HOXB33'UTR片段克隆重組至psi-CHECK2熒光素酶載體上，構建野生型psiCHECK2-HOXB3報告基因質粒（HOXB3-WT），另外將miR-373與HOXB3 3’UTR結合的位點定點突變后，將其克隆重組至熒光素酶載體上，構建突變型psi-CHECK2-HOXB3報告基因質粒（HOXB3-MUT）。參照脂質體2000說明書將構建的HOXB3-WT、HOXB3-MUT質粒分別同miR-373 inhibitor、inhibitor-NC共轉染至Ishikawa細胞中。轉染48h后，檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.2.3 Ishikawa細胞中miR-373表達檢測

采用實時熒光定量PCR進行測定。采用Trizol法提取轉染48 h后的各組Ishikawa細胞的總RNA，并在美國ACTGene公司的紫外分光光度計檢測RNA的濃度與純度。參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉錄，再以逆轉錄產物cDNA為模板，參照熒光定量PCR試劑盒說明書在瑞士Roche公司實時定量PCR儀上進行PCR擴增，以U6為管家基因，2法計算各組細胞中miR-373的表達水平。其中，來自上海生工生物公司的PCR引物為：miR-373，正向引物為5’-GGGAAGTGCTTCGATTTTG-3’，反向引物為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6，正向引物為5’-CTCAGAGCGTGGTTCTCCGTCAC-3’，反向引物為5’-TATAAATCTTTACCCTGTTGGCAGT-3’。

1.2.4 Ishikawa細胞中HOXB3蛋白檢測

采用免疫印跡法進行測定。胰酶消化收集轉染48 h后的各組Ishikawa細胞后，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，并采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白的濃度。將60μg沸水變性后的蛋白樣品上樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中行電泳分離。電轉至聚偏二氟乙烯膜并在5%脫脂奶粉中封閉2 h。以1∶1 000稀釋的HOXB3和GAPDH抗體4℃下孵育24 h后，以1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。經化學發光劑暗室中顯影曝光后，采用凝膠成像分析系統掃描分析HOXB3蛋白條帶的灰度值，以HOXB3蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示Ishikawa細胞中HOXB3蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.2.5 Ishikawa細胞增殖實驗

采用CCK-8法進行測定。將對數生長期的Ishikawa細胞以每孔10個接種至6孔細胞板上，按照1.2.1進行分組并轉染24 h、48 h和72 h后，參照CCK-8試劑盒說明書上全自動酶標儀檢測各組Ishikawa細胞在450nm處的光密度值。實驗重復3次。

1.2.6 Ishikawa細胞侵襲實驗

采用Transwell小室進行檢測。首先，以無血清培養基制備濃度為1 mg/mL的基質膠，并取50μL平鋪于孔徑為8μm的Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，室溫下使其充分融合。胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的各組Ishikawa細胞，加入無血清培養基饑餓處理12 h，并調整細胞濃度為3×10個/mL。取細胞懸液200μL加入到上層小室內，并在下層加入含血清的培養基600μL。置于二氧化碳細胞培養箱中常規培養24 h后，使用棉簽小心拭去上層內殘留的基質膠和細胞后，分別使用4%多聚甲醛和0.1%結晶紫對下表面細胞進行固定與染色。采用Olympus倒置顯微鏡觀察各組中的穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.2.7 Ishikawa細胞細胞凋亡實驗

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測Ishikawa細胞的凋亡能力。胰蛋白酶消化收集轉染48h后的各組Ishikawa細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作步驟在流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 miR-373和HOXB3表達靶向關系的驗證

HOXB33'UTR中存在miR-373的互補位點。與inhibitor-NC相比，miR-373 inhibitor可使轉染HOXB3-WT質粒細胞的熒光素酶活性明顯升高（

P

＜0.05）；然而HOXB3-MUT質粒細胞的熒光素酶活性在miR-373 inhibitor組與inhibitor-NC組差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表1。

表1 各組細胞熒光素酶活性和HOXB3蛋白表達水平的比較/±s

2.2 轉染后子宮內膜癌Ishikawa細胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor組、miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor+siHOXB3組細胞中miR-373的表達水平明顯降低，而HOXB3蛋白的表達水平明顯升高（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siHOXB3細胞中miR-373的表達水平無明顯改變（

P

＞0.05），而HOXB3蛋白的表達水平明顯降低（

P

＜0.05），但miR-373 inhibitor+siNC組細胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達與miR-373 inhibitor組相比均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達/±s

2.3 miR-373靶向HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖的影響

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor可使Ishikawa細胞增殖活力明顯降低（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siHOXB3組細胞增殖活力明顯升高（

P

＜0.05），而細胞增殖活力在miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor組之間無明顯變化（

P＞

0.05）。見表3。

表3 各組細胞光密度值的比較/±s

2.4 miR-373靶向HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞侵襲的影響

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor組、miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor+siHOXB3組中穿膜細胞數明顯減少（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siNC組中穿膜細胞數無明顯變化（

P＞

0.05），但miR-373 inhibitor+siHOXB3組中穿膜細胞數較miR-373 inhibitor組明顯增多（

P

＜0.05）。見表4。

表4 各組中穿膜細胞數的比較/±s

2.5 miR-373靶向HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡的影響

與inhibitor-NC組（8.75±1.23）相比，miR-373 inhibitor組（25.64±3.38）、miR-373 inhibitor+siNC組（28.48±3.26）和miR-373 inhibitor+si-HOXB3組（14.25±2.02）細胞凋亡率均明顯升高（

P

＜0.05），且miR-373 inhibitor組明顯高于miR-373 inhibitor+siHOXB3（

P

＜0.05），但miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor組之間差異無統計學意義（

P＞

0.05）。四組比較，

F

=113.410，

P＜

0.001。

3 討論

子宮內膜癌是一種常見的婦科腫瘤，過去十年里其死亡率以1.4%比例上升；在2017年中約有6.1萬人受其影響，1.092萬人因其死亡。盡管目前的手術治療、放化療等治療技術已取得了很好的成績，但部分子宮內膜癌的患者的治療效果并不理想。因此，深入探討子宮內膜癌的發病機制以更好地治療子宮內膜癌是十分必要的。

miRNAs是一類短小的非編碼RNA，影響細胞增殖、侵襲和凋亡等生物過程，參與腫瘤的發生發展。miR-373是miRNAs中重要一員，其在腫瘤中的作用逐漸引起關注。Shi Y等研究發現，miR-373在胃癌組織中表達上調，且可通過調控波形蛋白的表達在胃癌轉移中發揮致癌作用。Zhang X J等在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞中發現miR-373異常高表達，且體外上調miR-373表達可通過靶向調控POZ蛋白（SPOP）促進癌細胞增殖、侵襲和遷移。Li Y等研究指出，miR-373在腎細胞癌中高表達，抑制其表達可抑制癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。盡管miR-373在子宮內膜癌中已有研究，但具體的調控機制尚不完全明了。

HOXB3是一類與腫瘤發生發展關系密切的調控基因，具有同源異形盒DNA結構，可編碼60個氨基酸殘基。在膠質母細胞瘤和白血病等腫瘤中HOXB3水平異常，通過細胞增殖、侵襲和凋亡等過程調控作為癌因子或抑癌因子發揮作用。Chen H等研究指出，HOXB3在子宮內膜癌組織中低表達，并可通過影響細胞增殖、侵襲和凋亡等起腫瘤抑制作用。本研究證實HOXB3是miR-373的靶基因；采用常規生物學手段檢測發現，轉染miR-373 inhibitor成功下調miR-373表達后發現，子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、侵襲能力明顯減弱。該結果反向印證了Li Y等所得出的上調miR-373促進子宮內膜癌細胞侵襲和增殖的實驗結果。本研究還發現，下調miR-373表達后發現，子宮內膜癌Ishikawa細胞中HOXB3蛋白的表達水平和細胞凋亡率明顯升高。結果表明，miR-373可通過調控細胞增殖、侵襲和凋亡參與子宮內膜癌的發生與發展，其分子機制可能與調控HOXB3表達有關。此外，本研究通過轉染HOXB3干擾序列HOXB3 siRNA成功下調子宮內膜癌Ishikawa細胞中HOXB3表達后發現，miR-373低表達對Ishikawa細胞增殖、侵襲的抑制作用及促凋亡作用得到部分逆轉。這提示，在子宮內膜癌中miR-373可通過靶向調控HOXB3影響癌細胞增殖、侵襲和凋亡；此外，miR-373除了靶向調控HOXB3表達外，其可能還通過其他機制發揮作用。

綜上所述，下調miR-373表達可通過靶向HOXB3抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、侵襲并促進細胞凋亡，該結果豐富了子宮內膜癌發生發展的分子機制，也為miR-373有望成為子宮內膜癌的候選靶基因提供了新的參考依據。