癌胚抗原相關細胞黏附分子6和增殖細胞核抗原在涎腺黏液表皮樣癌中的表達及臨床意義

馬賽，安峰，李立恒，林媛媛，汪佳

黏液表皮樣癌（mucoepidermoid carcinoma，MEC）是口腔頜面部常見的一類涎腺上皮源性惡性腫瘤。最新研究顯示，在我國北方地區涎腺MEC在口腔頜面部惡性腫瘤當中的占比高居第二位。目前普遍認為腫瘤細胞的增殖活性能夠準確的反映惡性腫瘤的惡性程度，與腫瘤的治療、復發、轉移有著密切的相關性。癌胚抗原相關細胞黏附分子6（CEACAM 6）是癌胚抗原（CEA）家族當中的成員之一，它主要存在于哺乳動物細胞表面和細胞膜上，起到調節細胞間黏附的作用。有研究證實，CEACAM 6高表達可以引起腫瘤組織增生和腫瘤細胞增殖活性的增強。增殖細胞核抗原（Ki-67）作為一種非常可靠的判斷腫瘤細胞增殖活性的標志物，目前普遍應用于臨床。故本研究采用免疫組織化學法檢測CEACAM 6與Ki-67在不同臨床病理特征的涎腺MEC組織中的表達情況，以期進一步提高臨床對涎腺MEC增殖活性的認識。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2005年6月至2014年10月河北北方學院附屬第一醫院病理科留存的涎腺MEC病人石蠟標本50例，其中男22例，女28例。以上病例均為涎腺原發腫瘤，均有完整的臨床病理資料，治療方式均為手術擴大切除原發灶，有頸淋巴結轉移者行頸淋巴結清掃術；所有病例術前均未接受放療、化療及免疫治療等其他治療。另取與手術同期切取的正常涎腺組織30例及30例涎腺多形性腺瘤（SPA）作為實驗對照組。以上所有病理標本均由兩名資深病理科醫師分別按照WHO 2005年涎腺腫瘤組織分類法確認診斷的準確性。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 標本處理及檢測方法

所有石蠟標本均嚴格按照免疫組織化學SP法處理。3%甲醇-雙氧水在常溫下孵育10 min，以滅活內源性的過氧化物酶，PBS沖洗標本，滴加10%山羊血清封閉標本內游離的結合位點，滴加特異性一抗、二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加辣根酶HRP標記鏈酶卵白素工作液，PBS沖洗，DAB顯色，復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。兔抗人CEACAM 6單克隆濃縮抗體購于英國Abcam公司，Ki-67抗體購自Santa Crue公司，DAB顯色試劑盒購于博士德公司。

1.3 結果判定

細胞質內出現顆粒狀棕黃色染色的標本被認定為CEACAM 6表達陽性細胞。細胞核中出現棕黃色染色顆粒的標本被認定為Ki-67表達陽性細胞。繼而以細胞染色程度及染色細胞百分率來對標本做進一步評定。染色程度：基本無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；染色細胞百分率：無為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。染色程度得分與染色細胞百分率得分各自相乘：0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為陽性（++），6分以上為強陽性（+++），將陰性和弱陽性表達定義為陰性組，陽性和強陽性表達定義為陽性組。

1.4 統計學方法

運用SPSS 17．0統計軟件對數據進行整理分析，用百分率表示計數資料，采用

χ

檢驗分析CEACAM 6和Ki-67的表達與臨床病理參數的關系，兩組間比較設

P

＜0.05為差異有統計學意義，三組之間兩兩比較采用

P

值修正的方法，即

P

＜0.016 7為差異有統計學意義。兩者表達的相關性采用Spearmen檢驗，設

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CEACAM 6、Ki-67在MEC、SPA、正常涎腺組織中的表達比較

在涎腺MEC、SPA及正常涎腺組織中，CEACAM 6均呈棕黃色顆粒狀表達于細胞的胞質中，而Ki-67則呈棕黃色顆粒表達于細胞核中。涎腺MEC組的CEACAM 6、Ki-67陽性率均明顯高于其余兩組，差異有統計學意義（

P

＜0.0167）。見表1。

表1 CEACAM 6、Ki-67在三組中的表達比較/例（%）

2.2 CEACAM 6、Ki-67在不同臨床病理特征的涎腺MEC中的表達

在涎腺MEC組織中病理分級Ⅲ級者CEACAM 6、Ki-67表達陽性率均明顯高于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者（

P

＜0.05），TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者CEACAM 6、Ki-67表達陽性率均明顯高于TNM分期I+II者（

P

＜0.05），有淋巴結轉移者CEACAM 6、Ki-67表達陽性率均明顯高于無淋巴結轉移者（

P

＜0.05），而在不同性別、年齡、部位組中CEACAM 6、Ki-67表達陽性率差異無統計學意義（

P

＞0.05），見表2。

表2 不同病理特征的涎腺MEC中CEACAM 6、Ki-67的表達/例（%）

2.3 涎腺MEC組織中CEACAM 6和Ki-67表達的相關性分析

涎腺MEC組織中CEACAM 6和Ki-67二者共同陽性表達例數為24例，共同陰性表達例數為15例，Spearmen相關性分析顯示CEACAM 6和Ki-67的表達呈正相關（

r

=0.551，

P

＜0.001）。

3 討論

現代腫瘤學研究認為，增殖與分化是細胞生命進程中相輔相成的必然過程，細胞一旦出現增殖失控則必然會伴有分化異常；反之，細胞異常分化的程度也與細胞增殖失控呈正相關。目前，通過檢測腫瘤細胞增殖活性來評價腫瘤的惡性程度、判斷預后已獲得腫瘤學研究的共識。CEACAM 6基因（又稱為CD66c）定位于19號染色體q13.2，其編碼的蛋白包含266個氨基酸殘基，分子量為90-95 kD。CEACAM 6蛋白主要通過脂筏結構發揮細胞內信號轉導、識別和鏈接功能。Cameron等在研究CEACAM 6在頭頸部鱗癌中的表達情況時發現，腫瘤組織中過表達的CEACAM 6可以促進腫瘤生長增殖并抑制細胞凋亡。進一步研究發現，CEACAM6通過與表皮生長因子（EGF）受體（EGFR）相互作用并增強EGFR的活性的方式來促進口腔鱗狀細胞癌的侵襲和轉移。國內研究顯示，高表達的CEACAM 6通過抑制腫瘤浸潤淋巴細胞的浸潤對腫瘤的生長與轉移產生明顯的促進作用。以上研究均證實CEACAM 6在病理條件下通過調節細胞黏附、阻斷細胞分化、抑制失巢凋亡，使細胞極性消失、增殖失控，并形成有利于腫瘤組織侵襲、轉移的微循環，從而影響腫瘤組織的生物學行為。另有多項研究顯示，CEACAM 6在同一系統的正常組織、良性腫瘤組織與惡性腫瘤組織中的表達逐級升高，這一現象很可能與CEACAM 6參與細胞從G0/G1期向S期轉化過程的調控有關，從而也證實了CEACAM 6可以促進正常細胞向腫瘤細胞發展這一理論。以上這些研究均證實CEACAM 6有作為理想的腫瘤標志物的潛質，目前國內外均已有相關臨床試驗把CEACAM 6作為惡性腫瘤早期診斷的備選指標之一。本研究檢測了CEACAM 6在涎腺MEC組織中的表達情況，結果證實CEACAM 6與涎腺MEC組織的病理分級、TNM分期、有無淋巴結轉移密切相關，說明在涎腺MEC組織中CEACAM 6同樣發揮著促癌基因的作用。另外，CEACAM 6在涎腺MEC與多形性腺瘤中的表達有顯著差異，說明檢測CEACAM 6的表達水平有助于臨床良惡性腫瘤的鑒別診斷。

Ki-67是一種能夠準確反映細胞增殖活性的核蛋白，它主要表達于有增殖活性的細胞中，而在無增殖活性的細胞內則缺乏此蛋白。在多種惡性腫瘤組織中Ki-67的表達水平均能較準確地反映細胞的增殖程度，因此，人們普遍認為Ki-67的表達水平對腫瘤的發生、發展有顯著影響。這一結論在涎腺MEC組織中一樣適用。通過檢測Ki-67的表達水平來評估腫瘤的惡性程度、判斷預后這一理論是現代腫瘤學研究的廣泛共識。為了進一步驗證CEACAM 6對涎腺MEC組織增殖的影響，本研究選取了Ki-67作為聯合研究對象。研究結果顯示，Ki-67的表達情況與以往研究相一致；CEACAM 6的表達與Ki-67的表達呈正相關，說明在涎腺MEC組織中CEACAM 6的過表達造成腫瘤組織增殖失控，從而影響了腫瘤組織的生物學行為。進一步分析其機制可能為CEACAM 6的過表達激活了磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）通路。作為一種細胞膜表面受體，當CEACAM 6蛋白與細胞外界信號結合后可激活細胞膜上的PI3K，繼而活化的PI3K激活其下游的AKT，AKT活化后隨即激活了mTOR，活化的mTOR使其下游底物真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1（4EBP1）磷酸化，磷酸化后的4EBP1失去了與真核細胞翻譯啟動因子（eIF4E）結合的能力，從而使eIF4E解離出來與其他翻譯起始因子結合，啟動了蛋白質的翻譯，Ki-67蛋白正是受eIF4E調控的蛋白之一。

綜上所述，在涎腺腫瘤組織中CEACAM 6與Ki-67異常高表達提示腫瘤惡性的可能性較大，而在涎腺MEC組織中CEACAM 6與Ki-67高表達則預示著腫瘤惡性程度高、侵襲性強、淋巴結轉移率高。臨床通過檢測CEACAM 6與Ki-67有助于涎腺腫瘤的良惡性預判及涎腺MEC惡性程度的評估。進一步驗證CEACAM 6與Ki-67在涎腺MEC組織中發揮作用的具體機制，有望為涎腺MEC的精確診斷及靶向治療提供科學依據。