肺結(jié)核病人外周血長鏈非編碼RNA MIR155宿主基因的表達(dá)研究

梁伊樂，胡新俊，岳峰，徐蕓

肺結(jié)核屬臨床常見傳染病，中國當(dāng)前逐年呈上升趨勢，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中多種免疫細(xì)胞、因子參與其中。由于肺部感染類疾病癥狀類似，肺結(jié)核早期臨床特征不明顯且不出現(xiàn)較高特異性，在診治時極易出現(xiàn)誤診或漏診，從而影響肺結(jié)核的治療。因此尋找較高特異性的因子有利于診斷肺結(jié)核。長鏈非編碼RNA（long noncoding RibonucleicAcid，LncRNA）在疾病診斷中有一定應(yīng)用，長鏈非編碼肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（LncRNAMALAT1）在診斷肺結(jié)核中具有一定價值，但MALAT1與免疫之間是否有關(guān)尚不明確，長鏈非編碼RNA MIR155宿主基因（LncRNAMIR155 HG）在哮喘病人中差異表達(dá)，影響哮喘。但LncRNA MIR155HG在肺結(jié)核中的研究尚未發(fā)現(xiàn)。因此，本研究擬通過研究肺結(jié)核外周血中LncRNA MIR155HG的情況，以及與T細(xì)胞相關(guān)基因的關(guān)系，為肺結(jié)核的診斷提供新的靶位點，具體結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2019年1月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院及洛陽市傳染病醫(yī)院就診的肺結(jié)核（肺結(jié)核組）治療病人126例，其中男85例、女41例；年齡范圍18～80歲，年齡（49.56±19.52）歲。同時取150例體檢健康者為對照組，其中男100例、女50例；年齡范圍19～80歲，年齡（50.62±18.56）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=0.020、

P

=0.889，

t

=0.462、

P

=0.645），具有可比性。

肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有病人均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》中關(guān)于肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合肺結(jié)核上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；②確診為肺結(jié)核病人；③年齡＞18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①激素使用病人；②合并糖尿病等免疫器官缺陷病人；③其他因素影響免疫功能病人。

所有病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 外周血血樣采集

健康對照組于體檢時早晨、肺結(jié)核病人入院后第二空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血5 mL于肝素抗凝管中。平均分成兩管，一管用于LncRNA MIR155HG的檢測，-20℃冰箱保存；另一管抽血當(dāng)天檢測相關(guān)T細(xì)胞水平。

1.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測外周血中LncRNA MIR155HG水平

從-20℃冰箱中取出外周血，TRIZoL（美國ThermoFisher，貨號S0001）法提取總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas，貨號K1622）反轉(zhuǎn)錄cDNA，qRT-PCR儀（美國ABI，型號4376600）對LncRNA MIR155HG、內(nèi)參β肌動蛋白（β-actin）擴(kuò)增。引物序列：MIR155HG，正向引物5’-TGGAACAAATTGCTGCCGTG-3’，反向引物5’-AGGTTGAACATCCCAGTGACC-3’；β-actin：正向引物5’-AACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’，反向引物5’-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3’。上樣體積20 μL，體系：2×SYBR

Premix Ex Taq

ⅡProbe QPCR Mix 10μL，cDNA 1μL（50 ng/μL），F(xiàn)/R（10μM）各0.5μL，雙蒸水8.0μL。反應(yīng)條件：95℃、60 s，94℃、30 s，62℃、45 s，45個循環(huán)。2法對LncRNA MIR155HG、內(nèi)參β-actin表達(dá)水平定量分析。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測外周血中T細(xì)胞指標(biāo)白介素（Interleukin，IL）-2、干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、IL-5、輔助性T細(xì)胞17A（Th-17A）水平

人ELISA IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5（美國abcam，貨號分別為ab46036、ab46025、ab215089、ab215536）、Th-17A（賽默飛世爾科技有限公司，貨號29-8179-65）試劑盒檢測外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A水平，操作按試劑盒具體步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血中LncRNA MIR155HG水平

肺結(jié)核組和對照組外周血中LncRNA MIR155HG相對表達(dá)量OD值分別為1.96±0.62、1.02±0.26，與對照組相比，肺結(jié)核組外周血中LncRNA MIR155HG水平升高（

t

=15.882，

P

＜0.05）

2.2 兩組外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A水平

與對照組相比，肺結(jié)核組外周血中IL-2、IFN-γ降低（

P

＜0.05），IL-4、IL-5、Th-17A升高（

P

＜0.05）。見表1。

表1 肺結(jié)核病人126例與體檢健康者150例外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A水平比較/（pg/mL，±s）

2.3 肺結(jié)核病人外周血中LncRNA MIR155HG與IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A的關(guān)系

Pearson法分析結(jié)果顯示，肺結(jié)核病人外周血中LncRNA MIR155HG與IL-5相關(guān)性不明顯（

P

＞0.05），與IL-2、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)（

P

＜0.05），與IL-4、Th-17A呈正相關(guān)（

P

＜0.05）。見表2。

表2 肺結(jié)核病人外周血中LncRNA MIR155HG與IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A的關(guān)系

2.4 影響肺結(jié)核的多因素分析

將肺結(jié)核是否發(fā)生為因變量，以LncRNA MIR155HG、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、Th-17A為水平自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示LncRNA MIR155HG、IL-4是影響肺結(jié)核的危險因素，IFN-γ是影響肺結(jié)核的保護(hù)因素，見表3。

表3 影響肺結(jié)核的多因素分析

2.5 外周血中LncRNA MIR155HG診斷肺結(jié)核的效能

ROC曲線顯示，外周血中LncRNA MIR155 HG水平預(yù)測肺結(jié)核的ROC曲線下面積為0.920（95%

CI

：0.880～0.960），截斷值為1.358，其敏感性為87.3%、特異性為99.2%。見圖1。

圖1 外周血中LncRNA MIR155HG預(yù)測肺結(jié)核ROC曲線圖

3 討論

肺結(jié)核在中國發(fā)病率逐年上升，感染人群廣、且男性多于女性。臨床以咳嗽、咳痰、發(fā)熱、咯血、胸悶、胸痛等為首發(fā)癥狀，與肺炎、肺肉瘤樣癌等其他呼吸疾病癥狀類似，缺乏特異性，病人多因出現(xiàn)臨床癥狀而就診，及早判定病情對于疾病治療安全有效。肺結(jié)核是結(jié)核分支桿菌感染肺部所致，且會引起多種并發(fā)癥和合并癥，使病人免疫功能下降，而免疫功能可反映機(jī)體對疾病的抵抗力水平，免疫功能降低使病人自身對疾病的調(diào)節(jié)能力減弱，結(jié)核分枝桿菌感染肺部加重，從而導(dǎo)致肺結(jié)核加重。

LncRNA是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，與肺結(jié)核疾病關(guān)系密切，歐青葉等已經(jīng)通過LncRNA芯片技術(shù)高通量檢測篩選出潛伏性結(jié)核感染者血漿中多種LncRNA，但具體發(fā)揮的功能卻尚不明確。Wang X等發(fā)現(xiàn)LncRNAH19靶向調(diào)控miR-22可抑制細(xì)胞的衰老、促進(jìn)細(xì)胞增殖從而促進(jìn)疾病發(fā)展；黃自坤等都對LncRNA MALAT1在結(jié)核感染病人中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LncRNAMALAT1可在肺結(jié)核中具有一定的診斷價值。LncRNA MIR155HG是一段長1 500 bp的LncRNA，因是miR-155的 宿 主 基 因 而 得 名。LncRNA MIR155HG在慢性心力衰竭中與心衰有一定關(guān)系，可反映病人心力衰竭程度；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中高表達(dá)，與疾病的活動度有關(guān)，可能誘發(fā)炎癥，可作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動度評估和預(yù)后判斷指標(biāo)。LncRNA MIR155HG在肺結(jié)核病人中尚無發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。本研究通過qRT-PCR檢驗肺結(jié)核病人外周血中的LncRNA MIR155HG水平，發(fā)現(xiàn)LncRNA MIR155HG在肺結(jié)核病人外周血中水平升高，是否可作為診斷指標(biāo)需進(jìn)一步驗證。

T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。Th1、Th2在肺結(jié)核免疫反應(yīng)中研究廣泛，可對結(jié)核分支桿菌感染的肺結(jié)核起保護(hù)作用。Th1主要對抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和原蟲的免疫反應(yīng)和遲發(fā)性超敏反應(yīng)，主要分泌IL-2、IFN-γ等，其中IFN-γ是特征因子；Th2細(xì)胞可輔助B細(xì)胞分化參與體液免疫，主要分泌IL-4、IL-5等，其中IL-4是特征因子，當(dāng)機(jī)體受到異己抗原攻擊時Th1細(xì)胞功能減弱、Th2細(xì)胞功能增強(qiáng)即可引起異常免疫應(yīng)答。Th17主要分泌Th17A，在肺結(jié)核中水平升高導(dǎo)致感染細(xì)菌數(shù)量減少。本研究顯示肺結(jié)核組外周血中IL-2、IFN-γ降低，IL-4、IL-5、Th-17A升高，肺結(jié)核病人外周血中Th1水平降低、Th2水平升高機(jī)體發(fā)生異常免疫應(yīng)答，Th17水平升高可能降低結(jié)核分支桿菌感染肺結(jié)核的數(shù)量從而緩解疾病。

肺結(jié)核中影響LncRNA影響T細(xì)胞從而疾病已有報道，但具體關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病人外周血中LncRNA MIR155HG與IL-2、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，與IL-4、Th-17A呈正相關(guān)。提示肺結(jié)核病人外周血中LncRNA MIR155HG與Th1、Th2、Th17免疫功能關(guān)系密切，可能影響這些免疫功能細(xì)胞從而影響疾病。同時發(fā)現(xiàn)LncRNA MIR155HG、IL-4是影響肺結(jié)核的危險因素，IFN-γ是影響肺結(jié)核的保護(hù)因素。LncRNA MIR155HG、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低均有可能發(fā)生肺結(jié)核。進(jìn)一步研究ROC曲線顯示，外周血中LncRNAMIR155HG水平預(yù)測肺結(jié)核的ROC曲線下面積為0.920，截斷值為1.358，其敏感性為87.3%、特異性為99.2%。當(dāng)ROC曲線下面積大于0.900時，具有較高的診斷價值。LncRNA MIR155HG對于診斷肺結(jié)核診斷價值較高，當(dāng)外周血中LncRNA MIR155HG水平高于1.358時發(fā)生肺結(jié)核的概率較高。

綜上所述，肺結(jié)核病人外周血中LncRNA MIR155HG水平升高，與T細(xì)胞關(guān)系密切，是肺結(jié)核的危險因素，同時對肺結(jié)核具有較高的診斷價值，有望成為肺結(jié)核診斷及預(yù)后預(yù)測的潛在標(biāo)志物。本研究中發(fā)現(xiàn)LncRNA MIR155HG與T細(xì)胞有關(guān)，具體機(jī)制尚不明確，有待下一步深入探究。