E盒結(jié)合鋅指蛋白2促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549遷移的作用研究

江守偉，王東升

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率都較高的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移是肺癌臨床治療失敗的主要原因，因此，更加深入的理解肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對其臨床治療具有至關(guān)重要的意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）指在特定的生理病理條件下，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，獲得間質(zhì)表型，細(xì)胞之間的黏連減弱，細(xì)胞與基底膜之間的橋梁破壞，轉(zhuǎn)移能力明顯提升的一種生物學(xué)過程。EMT最早發(fā)現(xiàn)于胚胎發(fā)育階段，在創(chuàng)傷修復(fù)、組織重構(gòu)過程中也發(fā)揮重要作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)，EMT也參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，腫瘤細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到新的部位，形成轉(zhuǎn)移灶，因此，EMT被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要初始步驟。在EMT轉(zhuǎn)化過程中，腫瘤細(xì)胞的上皮型表型逐漸消失，細(xì)胞形態(tài)變得梭長，更適合游走，細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基底膜之間連接減弱，運(yùn)動能力增強(qiáng)。E-鈣黏素（E-cadherin）是上皮型細(xì)胞的標(biāo)志物，E-cadherin表達(dá)減少是EMT轉(zhuǎn)化的重要分子標(biāo)志。

一系列轉(zhuǎn)錄因子參與了EMT轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控，包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Snai2（Slug）、轉(zhuǎn)錄因子E盒結(jié)合鋅指蛋白1（ZEB1）等，研究報道，這些轉(zhuǎn)錄因子可通過直接結(jié)合E-cadherin啟動子上的E-box序列（CANNTG，N指隨意堿基），抑制其轉(zhuǎn)錄，從而減弱其表達(dá)，促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化的發(fā)生。ZEB2是ZEB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，研究報道ZEB2在多種腫瘤中處于高表達(dá)狀態(tài)，包括結(jié)直腸癌、前列腺癌和胰腺癌等。越來越多的證據(jù)顯示ZEB2涉及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)ZEB2可促進(jìn)肝癌和腎癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，提高它們的轉(zhuǎn)移能力。然而，ZEB2和肺癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系及機(jī)制并不明確。2018年3月至2019年5月為此進(jìn)行了本研究，我們的研究為肺癌轉(zhuǎn)移提供了一些重要的分子標(biāo)靶和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺腺癌A549細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。使用RPMI1640+10%胎牛血清的培養(yǎng)基在5%二氧化碳、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

抗體ZEB2、E-cadherin和β-actin購自Santa Cruz公司，引物購自上海捷瑞生物工程公司，熒光定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR試劑購自TAKALA公司。

1.3 蛋白質(zhì)印跡檢測

A549細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)的處理后，棄培養(yǎng)基，用4℃預(yù)冷的PBS輕輕洗滌細(xì)胞表面2次，加入預(yù)冷的Western blotting及IP裂解液，在冰面上充分裂解20 min，將細(xì)胞全部刮下轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，4℃離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min離心30 min，收集上清至新的EP管。用BCA法測定每個樣品的蛋白濃度，每個樣本上樣30μg蛋白加入到8%SDSPAGE膠中，電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜（0.45 mm）上，PBS清洗PVDF膜1次，轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉配制的封閉液中室溫孵育2 h，ZEB2、E-cadherin和β-actin抗體均以1∶1 000比例稀釋后4℃孵育過夜，PBST洗滌PVDF膜3次后，以1∶5 000加入特異性二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗滌3次，加入ECL發(fā)光液在Western blotting曝光儀上曝光并拍照。

1.4 RT-PCR實驗

樣本經(jīng)相應(yīng)的處理后，加入1 mL Trizol試劑，按照提取流程，提取細(xì)胞中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，37℃15 min，85℃5 s將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA（cDNA），以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參進(jìn)行實時定量PCR檢測。檢測過程中所使用的引物序列如下：ZEB2，正向引物5’-AAG GAG CAG GTA ATC GCA AG-3’，反向引物5’-GGA ACCAGA ATGGGA GAA ACG-3’；Ecadherin，正向引物5’-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3’，反向引物5’-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3’；GAPDH，正 向 引 物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性32 s，95℃5 s，60℃32 s，72℃30 s，共45個循環(huán)。根據(jù)2法計算每個基因的相對表達(dá)量。

1.5 免疫組化實驗

肺癌病人癌組織樣本和癌旁組織樣本制備成切片后，烤片15 min，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ20 min，100%乙醇Ⅰ10 min，100%乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min。3%雙氧水37℃孵育10 min，PBS輕輕沖洗3次。在0.01 M檸檬酸鈉緩沖液中煮沸20 min，自然冷卻20 min至室溫進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS輕輕沖洗3次，10%山羊血清工作液37℃封閉30 min，傾去封閉液，加入ZEB2抗體（1∶200）4℃過夜，PBS輕輕沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS輕輕沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS輕輕沖洗3次，DAB/HO反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡拍照。腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)、胞核呈褐色為陽性。對染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，并將其分為4類：無（0）、弱棕色（1+）、中度棕色（2+）和強(qiáng)棕色（3+）。染色的范圍分為5類：0為陰性細(xì)胞，1為1%～25%，2為25%～50%，3為50%～75%，4為＞75%。使用強(qiáng)度和范圍的乘法（染色指數(shù)）來衡量蛋白的表達(dá)情況。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)ZEB2促進(jìn)A549細(xì)胞遷移能力

A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ZEB2質(zhì)粒和空載質(zhì)粒（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為對照組），分別進(jìn)行了RT-PCR和western blotting實驗。RT-PCR結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞中ZEB2基因表達(dá)量為（1.0±0.01），轉(zhuǎn)染ZEB2質(zhì)粒組細(xì)胞中ZEB2基因表達(dá)量為（8.45±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.0032）。Western blotting實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染ZEB2質(zhì)粒組細(xì)胞中ZEB2蛋白的表達(dá)明顯增高（圖1A）。將兩組細(xì)胞分別進(jìn)行Transwell遷移實驗，結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，過表達(dá)ZEB2可明顯提高A549細(xì)胞的遷移能力（圖1B），對照組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量為（48.3±4.2）個，過表達(dá)ZEB2組為（129.6±12.1）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.0021）。

圖1 過表達(dá)ZEB2促進(jìn)A549細(xì)胞遷移能力：A為轉(zhuǎn)染ZEB2過表達(dá)質(zhì)粒后ZEB2蛋白表達(dá)變化情況；B為過表達(dá)ZEB2后A549細(xì)胞遷移能力的變化

2.2 干擾ZEB2抑制A549細(xì)胞遷移能力

A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ZEB2基因干擾RNA和陰性干擾RNA（轉(zhuǎn)染陰性干擾RNA作為對照組），分別進(jìn)行RTPCR和western blotting實驗。RT-PCR結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞中ZEB2基因表達(dá)量為（1.0±0.04），轉(zhuǎn)染ZEB2干擾組細(xì)胞中ZEB2基因表達(dá)量為（0.23±0.08），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.0027）。Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染ZEB2基因干擾RNA組細(xì)胞中ZEB2蛋白的表達(dá)明顯降低（圖2 A）。將兩組細(xì)胞分別進(jìn)行Transwell遷移實驗，結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，干擾ZEB2可明顯降低A549細(xì)胞的遷移能力（圖2 B），對照組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量為（37.6±8.1）個，干擾ZEB2組為（12.3±3.2）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.0014）。

圖2 干擾ZEB2降低A549細(xì)胞遷移能力：A為轉(zhuǎn)染ZEB2干擾RNA后ZEB2蛋白表達(dá)變化情況；B為干擾ZEB2后A549細(xì)胞遷移能力的變化

2.3 ZEB2抑制E-cadherin的表達(dá)

A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ZEB2質(zhì)粒和空載質(zhì)粒，ZEB2基因干擾RNA和陰性干擾RNA，進(jìn)行了RT-PCR和Western blotting實驗。PT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)ZEB2可降低Ecadherin基因的表達(dá)，過表達(dá)空載質(zhì)粒組細(xì)胞中E-cadherin基因表達(dá)量為（1.0±0.01），過表達(dá)ZEB2組細(xì)胞中E-cadherin基因表達(dá)量為（0.51±0.07），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.0015）；干擾ZEB2可促進(jìn)E-cadherin基因的表達(dá)，干擾陰性對照組細(xì)胞中E-cadherin基因表達(dá)量為（1.0±0.02），干擾ZEB2組細(xì)胞中E-cadherin基因表達(dá)量為（2.32±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.0011）。Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)ZEB2可降低E-cadherin蛋白的表達(dá)，干擾ZEB2可促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)，見圖3。

圖3 ZEB2對A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

2.4 ZEB2和E-cadherin在肺癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色檢測了30對肺癌病人的癌組織和癌旁組織樣本中ZEB2和E-cadherin蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，癌組織中ZEB2蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。E-cadherin蛋白在癌組織中的表達(dá)顯著低于相對應(yīng)的癌旁組織，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)錄因子E盒結(jié)合鋅指蛋白2載體（ZEB2）和E-鈣黏素（E-cadherin）在肺癌組織中的表達(dá)情況：A為免疫組織化學(xué)染色圖；B為表達(dá)情況

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是限制肺癌臨床治療效果的主要因素，更好地了解肺癌轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制，對于肺癌治療來說具有重大意義。最近的研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT在肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。上皮型腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)表型后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞侵襲周邊基質(zhì)以及通過血液和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端組織的能力。伴隨著這種轉(zhuǎn)化過程，腫瘤細(xì)胞之間的黏附能力減弱，對抗化療放療的能力增強(qiáng)，免疫逃逸能力增強(qiáng)，并獲得了腫瘤干細(xì)胞樣特性。EMT轉(zhuǎn)化涉及多種腫瘤細(xì)胞，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌及前列腺癌等。在肺癌組織中發(fā)現(xiàn)多種EMT轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)，并且過表達(dá)EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist、ZEB1可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EMT轉(zhuǎn)錄因子ZEB2可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549的遷移能力，而敲除ZEB2則減弱了A549細(xì)胞的遷移能力。

ZEB2是ZEB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中展示了重要作用。抑制ZEB2表達(dá)可阻滯多種腫瘤的進(jìn)展，例如，ZEB2可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并與結(jié)直腸癌病人的預(yù)后密切相關(guān)；在肝癌細(xì)胞中，ZEB2可促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移過程；在胃癌細(xì)胞中，ZEB2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐受性；最近的一項研究表明，ZEB2在喉部鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮了原癌基因的作用，抑制其表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，在肺癌中ZEB2的作用機(jī)制并不是非常清楚，本研究中我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZEB2可抑制EMT標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，提高其遷移能力，而干擾ZEB2表達(dá)則發(fā)揮相反的作用，促進(jìn)了E-cadherin的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了EMT轉(zhuǎn)化，降低了肺腺癌細(xì)胞的遷移能力。臨床上，EMT和肺癌臨床預(yù)后的關(guān)系并不明確。非小細(xì)胞肺癌中，EMT被報道與腫瘤耐藥、干細(xì)胞特性以及預(yù)后存在相關(guān)性；也有文獻(xiàn)提出相反意見，認(rèn)為E-cadherin向N-cadherin表達(dá)轉(zhuǎn)化和非小細(xì)胞病人預(yù)后并沒有相關(guān)性。最新的研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的前緣部位EGFR和EMT信號出現(xiàn)高表達(dá)與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，ZEB2蛋白在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。除了侵襲轉(zhuǎn)移，EMT參與了多種腫瘤進(jìn)展的重要過程，如腫瘤干細(xì)胞特性、放化療耐藥、免疫逃逸等，在接下來的研究中，有必要進(jìn)一步的探討ZEB2與這些腫瘤惡性分子事件的關(guān)系及其中的分子機(jī)制。

總結(jié)來說，我們發(fā)現(xiàn)了過表達(dá)EMT轉(zhuǎn)錄因子ZEB2可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，提高其遷移能力，而抑制ZEB2表達(dá)則出現(xiàn)了相反的現(xiàn)象。ZEB2在肺癌組織中的表達(dá)比癌旁組織明顯增高。我們的研究提示抑制ZEB2可能成為肺癌臨床治療的作用靶點。