高效液相色譜法測定鹽酸伐地那非原料藥中的有關物質

黃美容，曹陽，黃順旺，曹明成

鹽酸伐地那非，英文名為Vardenafil hydrochloride，CAS：224785-91-5，化學名為2-［2-乙氧基-5-（4-乙基-哌嗪-1-磺酰基）苯基］-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑［5，1-f］-［1，2，4］三聯氮-4-酮單鹽酸鹽，于2003年8月在美國獲得批準上市，它是由德國拜耳和葛蘭素史克公司共同開發研制，伐地那非對PDE5的抑制作用遠遠高于對其他PDE的作用（高于PDE6的1.5倍，PDE1的130倍，PDE11的300倍）。適應癥：治療男性陰莖勃起功能障礙（ED），其作用機制是通過抑制人體陰莖海綿體內降解cGMP的磷酸二酯酶5型（PDE5），增加性刺激作用下海綿體局部內源性的一氧化氮的釋放，使得平滑肌松弛，增加人體陰莖海綿體血流，最終作用于陰莖海綿體，使海綿體平滑肌舒張，促進勃起。最新文獻報道，伐地那非還具有治療慢性前列腺炎、肺動脈高壓等作用。

鹽酸伐地那非的合成是以鄰乙氧基苯甲脒鹽酸鹽、N-乙基哌嗪等為起始物料，經過取代、縮合、環合、磺酰化、取代和成鹽等一系列化學反應制成鹽酸伐地那非。本實驗結合合成工藝路線及降解途徑分析，對以下雜質進行定量研究。

目前，國內相關文獻報道，均是采用乙腈-醋酸銨溶液體系，測定鹽酸伐地那非原料藥及制劑中的有關物質且最多控制了5個已知雜質（雜質A、雜質B、雜質C、雜質F、雜質G，各雜質結構見圖1）。本實驗采用乙腈-磷酸三乙胺緩沖液體系，新增了2個雜質（雜質D、雜質E，雜質結構見圖1），進行梯度洗脫，結果7個雜質峰之間、雜質與主成分（鹽酸伐地那非結構見圖1）峰之間的分離度均符合要求（≥1.5），其靈敏度好、準確度高，可作為原料藥有關物質檢查的測定方法。該研究尚未見文獻報道。

圖1 鹽酸伐地那非及各雜質結構示意圖

1 儀器與試藥

儀器：AG135電子天平、XP-6電子天平（METTLER TOLEDO）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），SPD-20A檢測器，SIL-20AC進樣器，島津LabSolutions DB Essentia工作站。試藥：鹽酸伐地那非對照品（批次20190301-J，99.7%）、雜質A（批次20190101，98.6%）、雜質B（批次20190112，98.4%）、雜質C（批次20190124，98.2%）、雜質D（批 次20181214，98.4%）、雜質E（批次20181226，97.6%）、雜 質F（批 次20181206，99.2%）、雜 質G（批 次20181025，96.8%）；鹽酸伐地那非原料（批次20190501、20190502、20190503），以上對照品及供試品均來源于合肥創新醫藥技術有限公司。除乙腈、三乙胺為色譜純、水為超純水外，其他均為分析純。

2 實驗方法

2.1 溶液的制備

混合雜質對照品溶液：精密稱取雜質A、B、C、D、E、F、G各約5 mg，置同一50 mL容量瓶中，加乙腈適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合雜質對照品貯備液；精密量取0.3 mL置100 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取鹽酸伐地那非原料適量，精密稱取20 mg，置100 mL量瓶中，加流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。1%對照溶液：精密量取上述供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

系統適用性溶液：精密稱取鹽酸伐地那非對照品約20 mg，置100 mL量瓶中，再精密量取雜質對照品貯備溶液0.3mL，置同一100 mL量瓶中，加流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件及系統適用性

流動相A：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH至3.0）-乙腈（90∶10），流動相B：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH至3.0）-乙腈（10：90），Agilent C柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫40℃；檢測波長242 nm；流速1.0 mL/min；進樣量20μL；采用梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

精密稱取雜質A、B、C、D、E、F、G適量，分別制備各雜質的對照品溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，進行定位，再進注系統適用性溶液進行液相色譜分析。見圖2，3。

圖2 各雜質定位色譜圖

系統適用性溶液中各已知雜質峰之間及與主成分峰與相鄰雜質峰之間的分離度均符合要求（≥1.5）。

圖3 系統適用性實驗色譜圖

3 實驗結果

3.1 專屬性

精密稱取鹽酸伐地那非原料約20 mg，6份，分別置100 mL量瓶中，其中1份作為破壞對照，另外5份分別進行60℃高溫破壞10 d、光照（4 500±500）lx破壞10 d、3%過氧化氫溶液（1 mL）破壞4 h、1 mol/L鹽酸溶液（1 mL）60℃水浴破壞8 h、1 mol/L氫氧化鈉溶液（1 mL）60℃水浴破壞8 h，酸、堿破壞結束時分別加等量的堿、酸進行中和，再用流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“2.2”項下色譜條件進樣分析。結果表明，本品在高溫、光照、酸、堿破壞條件下較穩定，僅產生少量的降解雜質；氧化破壞條件下不穩定，能產生明顯的降解雜質。高溫、光照、酸、堿、氧化破壞色譜圖顯示，本品主成分峰與相鄰雜質峰之間分離度良好（≥1.5），主成分峰純度因子符合要求，破壞前后物料基本守恒。

3.2 定量限、檢測限、線性范圍與校正因子

精密量取“2.1”項下的混合雜質對照品貯備液，加流動相A稀釋制成0.04～1.00μg/mL濃度范圍的一系列混合對照品溶液，精密量取20μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以各成分的濃度（μg/mL）為橫坐標（

X

），峰面積為縱坐標（

Y

），進行線性回歸，并以回歸方程的斜率計算各已知雜質相對于鹽酸伐地那非的校正因子（RCF），同時測定各成分的定量限與檢測限，結果見表2。

表2 鹽酸伐地那非有關物質線性和校正因子

3.3 重復性

取鹽酸伐地那非原料約20 mg，精密稱定，6份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備，在“2.2”色譜條件下進行測定，以外標法計算已知雜質的含量，主成分自身對照法計算未知雜質的含量，結果單雜含量（≥0.05%）的RSD均＜10%（

n

=6），總雜含量的RSD均＜5%（

n

=6）。

3.4 中間精密度

由另一人，取鹽酸伐地那非原料約20 mg，精密稱定，6份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備，換另一臺液相色譜儀，在“2.2”色譜條件下進行測定，以外標法計算已知雜質的含量，主成分自身對照法計算未知雜質的含量，結果單雜含量（≥0.05%）的RSD均＜15%（

n

=12），總雜含量的RSD均＜10%（

n

=12）。

3.5 準確度

精密稱取鹽酸伐地那非原料約20 mg，9份，每3份分別精密加入2.1項下的混合雜質對照品貯備液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制成低、中、高濃度的加樣供試品溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算各已知雜質的回收率，雜質A、B、C、D、E、F、G的 平 均 回 收 率 分 別 為99.8%、101.6%、102.4%、99.5%、100.5%、101.7%、103.6%，在99.5%～103.6%范圍內，RSD分別為1.8%、0.6%、1.2%、1.4%、0.9%、1.5%、0.9%，均＜2%。

3.6 溶液穩定性

按“2.1”項下制備混合雜質對照品溶液與供試品溶液，25℃放置，分別于0、2、4、8、12、24、48h精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，實驗結果表明：混合雜質對照品溶液各測定時間點的單個雜質峰面積與0 h比較，其相對平均偏差均小于2%；供試品溶液各測定時間點的單個雜質峰面積與0 h比較，大于0.05%的單個雜質峰面積的相對平均偏差均小于5%，且無新的降解雜質產生。

3.7 耐用性

分別調整柱溫（40±2）℃、檢測波長（242±2）nm、流速（1.0±0.05）mL/min及pH（3.0±0.2），同時更換不同品牌的色譜柱，考察色譜條件參數的變化對系統適用性溶液中雜質與主成分之間分離度的影響。實驗結果表明，柱溫、波長、流速及pH、不同品牌的色譜柱等參數的變化對系統適用性測定結果無影響，即鹽酸伐地那非和雜質A、B、C、D、E、F、G 7個已知雜質的分離度均符合要求（≥1.5），方法的耐用性良好。

3.8 樣品測定

按2.2項下的色譜條件及方法，對3批鹽酸伐地那非原料進行有關物質測定，以外標法計算已知雜質的含量，主成分自身對照法計算未知雜質的含量，結果見表3。

表3 鹽酸伐地那非有關物質檢測結果/%

4 討論

進口藥品注冊標準JX20030240中收載了3個已知雜質，分別為硫代二嗪酮酸、N-氧化物（Bay40-7424）、代謝物-1（Bay44-5576）。本研究在進口藥品注冊標準JX20030240的基礎上，結合鹽酸伐地那非的合成工藝路線，增加了中間體、反應副產物等工藝雜質的定量研究。另外，進口藥品注冊標準JX20030240中流動相體系為醋酸銨緩沖液-乙腈，其緩沖鹽濃度較高，鹽酸伐地那非主峰與雜質A分離度未達到1.5；為了改善雜質與雜質、雜質與主成分峰之間的分離度，本實驗采用常規的C18柱（l=0.25 m，Φ=4.6 mm）、乙腈-磷酸三乙胺緩沖液體系，進行色譜條件的篩選優化，最終確定梯度洗脫色譜條件，結果各雜質峰及主成分峰的峰形良好（拖尾因子均在0.8～1.2之間），分離度均符合要求（≥1.5），色譜條件的耐用性良好，方法準確、靈敏、精密度良好，可作為鹽酸伐地那非原料藥有關物質的檢測方法。