促性腺激素釋放激素拮抗劑對順鉑化療中小鼠卵巢的保護作用

熊露，胡雅君，李金麗，劉莉

隨著放化療等抗癌手段的進展，惡性腫瘤病人的生存率得到顯著提高。但研究發(fā)現(xiàn)高劑量化療藥物應(yīng)用在控制腫瘤生長、延續(xù)病人生命的同時，會出現(xiàn)多種副反應(yīng)，嚴(yán)重病人還可發(fā)生生殖功能障礙，造成卵巢功能減退甚至衰竭。流行病學(xué)研究提示約70%左右病人經(jīng)抗腫瘤治療后存在不孕和卵巢功能減退或衰竭的臨床癥狀，嚴(yán)重降低了女性病人生活質(zhì)量。

促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）激動劑能夠刺激相關(guān)性腺激素短時間內(nèi)快速升高，能夠即可抑制促性腺激素水平，更有利于人類生殖內(nèi)分泌軸的可逆性控制。文獻提示GnRH拮抗劑能夠減少激動劑1～2周的等待期，進而抑制垂體-性腺軸相關(guān)功能，但GnRH也可能存在骨礦物質(zhì)密度下降、熱潮紅等副反應(yīng)，相關(guān)研究資料也較為缺乏。故而，本研究深入探討了GnRH拮抗劑對化療中小鼠卵巢的保護作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥物

2018年10月至2019年10月，選取華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物中心購置的5～6周齡SPF級BALB/c雌性小鼠30只，體質(zhì)量范圍15～20 g，購自湖北省動物實驗中心，自由攝食和飲水，光暗12 h交替，室溫范圍20～25℃，相對濕度范圍50%～65%。將小鼠隨機數(shù)字表法分為A組、B組和C組，每組10只；順鉑和西曲瑞克均購于法國拜耳醫(yī)藥公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組方法及給藥

選取BALB/c雌性小鼠30只，飼養(yǎng)1周左右后隨機分為A組、B組和C組，A組腹腔注射等量生理鹽水（20 mg/kg），B組腹腔注射順鉑（20 mg/kg），C組腹腔注射順鉑（20 mg/kg）和GnRH拮抗劑-西曲瑞克（5 mg/kg），均于小鼠的2個性周期的第10天。每組研究進行了3次的重復(fù)試驗，每組小鼠數(shù)目10只，

1.2.2 血清測定

所有小鼠眼球取血后，3 000 r/min離心取血清，放射免疫法檢測血清促卵泡生成素（FSH）、黃體生成素（LH）和雌二醇（E2）水平。

1.2.3 卵巢組織觀察

取小鼠適量卵巢組織涂片，HE染色：梯度酒精脫水、蘇木素-伊紅染色，晾干、樹膠封片，高倍顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)情況。原始卵泡，一個卵母細(xì)胞被覆部分或單層梭形前顆粒細(xì)胞；初級卵泡，一個卵母細(xì)胞被覆單層柱狀顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間形成透；成熟卵泡，一個卵母細(xì)胞被覆多層的柱狀的顆粒細(xì)胞，出現(xiàn)卵泡腔卵泡體積顯著增大，卵泡腔增大，出現(xiàn)明顯的卵丘，卵泡向卵巢表面突出，卵母細(xì)胞周同出現(xiàn)放射冠。將每只小鼠雙側(cè)卵巢計數(shù)的各級卵泡數(shù)分別相加再乘10，即為小鼠各級卵泡的總數(shù)。

1.2.4 Western blot檢測

取所有小鼠適量卵巢組織，總蛋白使用組織勻漿法提?。蝗?0μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE裂解后轉(zhuǎn)膜，牛血清蛋白（30 g/L）2 h封閉、分別加入兔抗鼠凋亡基因（Bax）及凋亡調(diào)控基因（Bcl-2）一抗，4℃孵育后加入辣根化的免疫球蛋白G（IgG）二抗，孵育后曝光顯影。Western blot檢測定量軟件使用image J軟件。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠卵巢濕重比較

各組小鼠卵巢濕重B組（8.95±0.91）和C組（15.17±0.88）卵巢濕重明顯低于A組（18.04±0.82）（

P

＜0.05）；三組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=284.745，

P

=0.000）；各組兩兩比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.05）

2.2 各組小鼠各級卵泡數(shù)量比較

B組和C組原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡明顯低于A組（

P

＜0.05），其中C組原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡明顯高于B組（

P

＜0.05），見表1。

表1 BALB/c雌性小鼠30只各級卵泡數(shù)量比較/（個，±s）

2.3 各組小鼠卵巢組織HE染色

與A組比較，B組生長卵泡及成熟卵泡明顯減少，顆粒細(xì)胞排列紊亂，卵母細(xì)胞形態(tài)畸形，黃體細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核固縮，而C組有所改善。見圖1。

圖1 各組卵巢組織染色圖（HE×400）：A為A組；B為B組；C為C組

2.4 各組小鼠血清FSH、LH和E水平

B組和C組FSH和LH明顯高于A組（

P

＜0.05），而E、抗苗勒管激素（AMH）和基礎(chǔ)抑制數(shù)B（INHB）明顯低于A組（

P

＜0.05），其中C組FSH和LH明顯低于B組（

P

＜0.05），而E、AMH和INHB明顯高于B組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 BALB/c雌性小鼠30只血清FSH、LH和E2水平比較/±s

2.5 各組卵巢組織Bax、Bcl-2蛋白表達

B組和C組Bcl-2蛋白相對表達量明顯低于A組（

P

＜0.05），而Bax蛋白相對表達量明顯高于A組（

P

＜0.05），其中C組Bcl-2蛋白相對表達量明顯低于B組（

P

＜0.05），而Bax蛋白相對表達量明顯低于B組（

P

＜0.05）。見表3和圖2。

圖2 各組卵巢組織Bax、Bcl-2蛋白表達（Western blot檢測圖）

表3 BALB/c雌性小鼠30只卵巢組織Bax、Bcl-2蛋白表達/±s

3 討論

化療是抗腫瘤治療常用方法之一，但文獻提示化療在抑制病情進展，延長病人生存時間的同時還可損傷卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的功能及結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出月經(jīng)不調(diào)、不孕、骨質(zhì)疏松、盜汗、心血管及泌尿系統(tǒng)功能障礙癥狀，進而嚴(yán)重降低病人生活質(zhì)量。因而，化療過程中探尋保護卵巢功能、減少卵巢損害的方法具有一定必要性。

文獻提示GnRH激動劑能夠抑制女性性腺軸，降低化療藥損傷原始卵泡，進而保護卵巢。但是GnRH激動劑僅對垂體興奮作用較為短暫，因而在化療過程中保護卵巢功能的作用受到了一定限制。部分學(xué)者提出GnRH能夠結(jié)合垂體GnRH受體，進而對卵巢功能進行快速抑制，并有相關(guān)研究已經(jīng)證實，GhRH拮抗劑抑制垂體促性腺激素釋放激素受體和促性腺激素的作用顯著優(yōu)于GnRH激動劑，但具體作用效果和機制尚不明晰。

卵巢體質(zhì)量盡管無法對卵巢功能進行直接、準(zhǔn)確反映，但其與卵泡數(shù)量相關(guān)，卵巢體質(zhì)量的下降預(yù)示著卵巢可能受到順鉑損傷，進而出現(xiàn)纖維化失重。本研究各組小鼠卵巢濕重比較結(jié)果顯示B組和C組卵巢濕重明顯低于A組，其中C組卵巢濕重明顯高于B組。該結(jié)果說明GnRH拮抗劑能在降低順鉑對卵巢造成的纖維化損傷，進而保護卵巢。

研究發(fā)現(xiàn)卵泡對化療藥物具有較高敏感性，隨著化療時間推移，卵泡自然凋亡后卵泡的丟失數(shù)量升高，進而使女性出現(xiàn)卵巢早衰的癥狀。本研究各組小鼠各級卵泡數(shù)量結(jié)果顯示B組和C組原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡明顯低于A組，其中C組原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡明顯高于B組；與A組比較，B組生長卵泡及成熟卵泡明顯減少，顆粒細(xì)胞排列紊亂，卵母細(xì)胞形態(tài)畸形，黃體細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核固縮，而C組有所改善。該結(jié)果說明GnRH拮抗劑可降低順鉑對小鼠卵泡的損傷，其可能是通過抑制雌激素的分泌進而起到治療作用。

FSH是由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌，即卵泡刺激素，對人體的發(fā)育、生長以及生殖等生理過程均具有調(diào)控作用，進而促進生殖細(xì)胞的成熟；LH亦稱促間質(zhì)細(xì)胞激素，對作用于卵胞，而促進排卵并生成黃體；E主要由黃體、卵巢濾泡及妊娠時胎盤生成。本研究激素水平結(jié)果顯示B組和C組FSH和LH明顯高于A組，而EAMH和INHB明顯低于A組，其中C組FSH和LH明顯低于B組，而EAMH和INHB明顯高于B組。上述結(jié)果說明GnRH拮抗劑能夠抑制垂體-性腺軸相關(guān)功能并促進卵巢激素的分泌，證實GnRH拮抗劑具有改善卵巢儲備功能的作用。

Bax、Bcl-2是常見凋亡蛋白，能夠預(yù)示細(xì)胞凋亡情況。本研究中B組和C組Bcl-2蛋白相對表達量明顯低于A組，而Bax蛋白相對表達量明顯高于A組，其中C組Bcl-2蛋白相對表達量明顯低于B組，而Bax蛋白相對表達量明顯低于B組。該結(jié)果說明GnRH拮抗劑能夠抑制化療藥物對卵巢正常細(xì)胞的凋亡作用，進而保護小鼠卵巢，最大限度降低順鉑對小鼠卵巢的損害。在效應(yīng)方面，Bcl-2為保護因素，Bax過表達可拮抗前者的保護效應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)C組Bax蛋白相對表達量低于B組，說明C組的細(xì)胞凋亡具有更強的保護效應(yīng)。

綜上所述，GnRH拮抗劑可降低順鉑對小鼠卵巢的損害，保護小鼠卵巢儲備功能。