基于JNK/c-Jun信號通路探討孟魯司特鈉抑制小鼠腹主動脈瘤形成的機制

雍熙 王賢芝 張富釗 陳鏡全 鄭江華 陳開

(1川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637000；2廣元市第一人民醫院)

腹主動脈瘤(AAA)是一種常見的主動脈退行性疾病〔1〕，男性患者居多，主要是由于吸煙、高血壓、動脈硬化等因素導致主動脈膨脹隆起，目前AAA的發病率也逐年升高。雖然各種治療手段不斷改進，但其發病率仍居高不下，AAA造成的血管破裂，致死率較高，搶救成功率較低〔1〕。AAA是以炎癥浸潤與氧化還原系統紊亂為主要的特征性病變，發病時炎癥因子過度表達導致局部炎癥細胞浸潤，浸潤的炎癥細胞作用于氧化系統，造成氧化應激，促進AAA的啟動與形成〔2〕。以c-Jun為靶向蛋白的c-Jun氨基端激酶(JNK)，是哺乳類動物細胞內廣泛存在的信號通路〔3〕。研究證實〔4〕JNK信號通路可被細胞應激刺激和腫瘤壞死因子(TNF)-α激活，激活的JNK通路通過磷酸化或者細胞骨架相關蛋白因子或者調控相關蛋白酶及底物的表達，參與熱休克、氧化損傷等多種生物刺激反應，在人類多種疾病的發生與發展中起著關鍵的調控作用。孟魯司特鈉是一種治療支氣管哮喘的藥物，除了抗炎之外，同時具有抗氧化、改善血脂、改善血管內皮功能的作用〔5,6〕。研究表明〔7,8〕孟魯司特鈉可以有效抑制巨噬細胞聚集，減輕血管壁炎癥反應。本研究采用旨在探討孟魯司特鈉通過JNK/c-Jun信號通路對AAA小鼠的保護作用。

1 材料和方法

1.1試驗動物及主要試劑 8～10周雄性SPF級ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：〔SCXK(京)2011-0011〕；血管緊張素(Ang)Ⅱ(批號：SGA103 )、硼替佐米(批號：SE103 )采購自Sigma公司；孟魯司特鈉杭州默沙東制藥有限公司(批號：DISN230382)；TUNEL試劑盒(批號：SA625)購自博士德生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：2017030928)，化學發光試劑盒(批號：2017110812)購自廣東銳博生物科技技術股份有限公司；兔抗大鼠p-JNK(批號：PE210612)、p-c-Jun(批號：BE284321)、Bcl-2相關x蛋白(Bax)(批號：OE948589)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2(批號：SE398034)兔抗GAPDH(批號：C503028)及山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(批號：20170212)采購自美國abcam公司；小鼠白細胞介素(IL)-1(批號：AP1062)、IL-4(批號：A1209300)、IL-6(批號：A1805603)、IL-10(批號：E289180)檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；總膽固醇(批號：D29183874)、三酰甘油(批號：A294772884)、高密度脂蛋白(批號：M8782974)、低密度脂蛋白(批號：S20998313)試劑盒購自尚柏生物醫學技術有限公司。萬濠VTM-4030光學顯微鏡，上海長島生物技術有限公司AVDIA2400自動凝膠成像系統，佳能KS25數碼相機。

1.2模型構建和分組處理 實驗前大鼠適應性飼喂7 d，隨機分為四組，假手術組、模型組、陽性組、實驗組各30只，實驗前禁食24 h，以20 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，腹部除毛常規消毒，剪開腹部皮膚通過皮下埋植AngⅡ緩釋泵，AngⅡ以1 000 ng/(min·kg)灌注構建動物AAA模型，縫合皮膚，小鼠蘇醒后送入鼠房，假手術組開腹后直接縫合皮膚，不做埋植緩釋泵處理。陽性組和實驗組每天分別給予50 mg/kg硼替佐米和孟魯司特鈉，以2 ml生理鹽水配成懸液灌胃，假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續用藥4 w。

1.3小鼠血脂含量變化情況檢測 給藥4 w后空腹尾部采血利用總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量試劑盒檢測各指標變化，操作過程嚴格按照試劑盒的說明進行。

1.4腹主動脈直徑測定及AAA發生率計算 將小鼠麻醉，固定于手術臺上，剪斷頸動脈取血。剝離游離腎動脈至髂動脈之間的腹主動脈，從主動脈根部分叉離斷整個主動脈及主動脈的頸動脈分支。 置于手術臺上，觀察主動脈形態，數碼相機拍照，游標卡尺測量腎上腹主動脈最大外徑。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠腹主動脈內壁組織的病理學改變 取新鮮血管，生理鹽水洗滌，10%中性緩沖甲酸液固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、銅質模具包埋，連續切片4 μm的組織切片，二甲苯浸泡10 min脫蠟、梯度酒精浸泡，自來水沖洗30 min，經HE染色，65℃ 2 h，生理鹽水沖洗，鹽酸酒精分化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、伊紅染色，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.6小鼠血清內炎癥因子的檢測 小鼠處死前，尾部靜脈采血2 ml，4℃、3 000 r/min離心5 min，取上層血清，利用試劑盒檢測IL-1、IL-4、IL-6、IL-10的含量，操作過程嚴格按照試劑盒的說明進行。

1.7TUNEL染色檢測大鼠主動脈細胞凋亡 將主動脈組織石蠟切片，3%H2O2浸洗三次，PBS洗滌3次，加入0.01 1-間苯磺酸鈉基-5-硫基-1H-四氮唑(MTBS)，加入蛋白酶K溶液工作液在30℃室溫水解15 min，PBS洗滌3次，加入含2%過氧化氫的PBS，反應10 min，PBS洗滌；然后加入TUNEL反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應60 min，溫度37℃，PBS漂洗，加50 μl的conberter-POD，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃，PBS漂洗，然后加入DAB 20℃反應15 min，PBS漂洗，蘇木素復染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，凋亡陽性細胞呈棕黃色，在光學顯微鏡下計數，5個高倍視野中凋亡陽性心肌細胞數量占總細胞數量為細胞凋亡陽性指數(AI)。

1.8Western印跡檢測p-JNK、p-c-Jun、Bax和Bcl-2蛋白的表達 取出-20℃冰凍主動脈組織200 g，超聲勻漿充分裂解組織，將混合物置于低溫離心機12 000 r/min離心，取上清即為蛋白溶液。加入100 μl蛋白質于96孔板中，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，濾紙吸干，加入相應一抗，37℃孵育20 min，PBS洗滌，加入酶標二抗，37℃10 min，加入底物顯色，終止液終止反應，酶標儀在450 nm處測吸光值。BCA定量法檢測蛋白濃度，待測樣品和上樣緩沖液混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

1.9統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組小鼠血漿內TC、TG、LDL、HDL含量 與假手術組相比，模型組TC、TG、LDL明顯升高，HDL含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性組和實驗組的TC、TG、LDL明顯下降，HDL含量明顯升高(P<0.05)；陽性組和實驗組相比，TC、TG、LDL、HDL含量差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血漿內TC、TG、LDL、HDL含量比較

2.2各組小鼠腹主動脈直徑測定及AAA發生率 手術剝離小鼠腹主動脈，模型組腹主動脈表面有明顯的隆起，陽性組、實驗組動脈壁有隆起但較模型組輕，假手術組未見明顯隆起(圖1)。與假手術組相比，模型組腹主動脈直徑及AAA發生率明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、實驗組腹主動脈直徑及AAA發生率明顯降低(P<0.05)；陽性組和實驗組相比，腹主動脈直徑及AAA發生率差異不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 各組腹主動脈直徑測定及AAA發生率比較

圖1 AAA小鼠腹主動脈解剖

2.3各組小鼠腹主動脈組織病理變化 模型組小鼠主動脈壁增厚、多見內膜斑塊、外膜增厚、內膜多見出血點且有炎癥浸出；假手術組動脈壁細胞排列整齊、細胞結構清晰，未見急性出血點和斑塊，管壁較薄；陽性組和實驗組小鼠管壁可見較少的膠原沉積，管壁細胞完整的且排列有序，外膜明顯比模型組薄且少見炎癥反應，見圖2。

圖2 孟魯司特鈉對AngⅡ誘導AAA小鼠腹主動脈組織病理變化的影響(HE)

2.4各組小鼠血清內炎癥因子含量 模型組IL-1、IL-4、IL-6、IL-10顯著高于假手術組(P<0.05)，陽性組、實驗組IL-1、IL-4、IL-6、IL-10顯著低于模型組(P<0.05)；陽性組、實驗組相比，差異不顯著(P>0.05)，見表3。

表3 各組血清內IL-1、IL-4、IL-6、IL-10含量比較

2.5各組小鼠腹主動脈壁細胞凋亡 TUNEL染色凋亡陽性細胞細胞核呈棕黃色。與假手術組〔(12.62±1.49)%〕相比，模型組〔(81.06±1.55)%〕明顯升高，陽性組〔(33.46±2.06)%〕、實驗組〔(34.54±2.03)%〕與模型組相比均明顯下降(P<0.05),見圖3；模型組的Bcl-2/Bax(0.48±0.04)顯著低于假手術組(2.68±0.11,P<0.05)，陽性組(1.61±0.12)、實驗組Bcl-2/Bax(1.68±0.08)顯著高于模型組(P<0.05)，見圖4。

圖3 各組小鼠腹主動脈壁細胞凋亡(TUNEL，×400)

圖4 Western印跡檢測各組Bax、Bcl-2蛋白表達

2.6各組小鼠腹主動脈壁細胞p-JNK、p-c-Jun表達 與假手術組相比，模型組小鼠腹主動脈壁細胞p-JNK、p-c-Jun顯明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，陽性組和實驗組小鼠腹主動脈壁細胞p-JNK、p-c-Jun表達明顯降低(P<0.05)，見表4、圖5。

表4 各組腹主動脈壁細胞 p-JNK、p-c-Jun蛋白相對表達量

圖5 各組腹主動脈壁細胞p-JNK、p-c-Jun表達

3 討 論

AAA是由于主動脈壁增生變厚、彈性減弱、纖維及膠原蛋白喪從而導致腹主動脈形態及功能變化的心血管疾病。目前隨著老齡化、高血壓、高血脂人群的增多，該疾病愈演愈烈〔9〕，調查顯示〔10〕，AAA的發病率為5%～10%，一旦破裂死亡率超過70%，主動脈瘤目前治療主要依靠人工切除及血管置換腹主動脈手術進行，但對于直徑小于5.5 cm的瘤體，治療效果不佳〔11〕，對于此類患者，采用控制血流動力學或降低血管脂質含量來控制瘤體發展，研究表明通過藥物控制血脂含量可明顯延緩瘤體的生長〔12〕。本研究表明孟魯司特鈉可以抑制血管內脂肪物質的沉淀，延緩瘤體的發生發展。

AAA是以動脈壁的異常降解，動脈粥樣硬化及脂質浸潤為主要的病理特征〔13〕，嚴重危害人們身體健康的一種疾病，文獻報道〔14〕稱AAA最先出現炎性浸潤，隨著病情的發展彈力纖維降解，血管機械強度降低，最終引起不可逆的主動脈壁局限性瘤體，本研究結果提示孟魯司特鈉能夠降低血管瘤的發生率。

文獻報道〔15〕稱，炎癥反應介導的細胞凋亡在AAA的發生發展中起重要作用，是AAA發生重要因素，因此減少炎癥反應可以有效減少AAA的發病率。既往研究結果〔16〕顯示孟魯司特鈉可以明顯抑制AAA模型細胞凋亡。Bax作為促凋亡基因，主要通過與線粒體結合，促進其釋放促凋亡蛋白誘導凋亡，而Bcl-2則會阻止Bax與線粒體結合，從而抑制細胞凋亡〔17〕。本研究結果提示孟魯司特鈉能夠抑制血管壁細胞凋亡。

研究表明〔18〕JNK/c-Jun信號通路對調節細胞生長、蛋白合成、細胞代謝至關重要，該通路的活化與細胞炎癥反應密切相關。JNK/c-Jun信號通路活化是通過磷酸化JNK的T172位點，激活的JNK直接作用于c-Jun，加重炎癥反應從而誘導細胞凋亡〔19,20〕。本研究結果提示JNK/c-Jun信號通路參與了AAA的發生發展，孟魯司特鈉治療后，p-JNK、p-c-Jun水平明顯降低，說明孟魯司特鈉可能是通過抑制JNK/c-Jun信號通路保護AAA小鼠血管功能。

綜上，孟魯司特鈉可以保護血管緊張素Ⅱ誘導的ApoE 基因敲除小鼠AAA的形成，其機制可能是通過抑制血管脂肪沉積及抑制JNK/c-Jun信號通路降低炎性反應來完成。