通絡玉液湯干預APDN、AngⅡ和細胞內Ca2+濃度對糖尿病大鼠大血管纖維化的影響

楊艷梅 張山起 李淑貞 胡慶 趙琳杰

(1滄州醫學高等專科學校,河北 滄州 061001；2滄州職業技術學院)

調查顯示〔1～3〕，中國成人糖尿病(DM)的患病率為10.9%，DM患者的全因死亡率明顯高于無糖尿病者，其中DM造成的心血管疾病死亡率的增加尤為突出。血管纖維化是DM患者大血管組織學病變的主要特征之一〔4〕。本實驗通過血清脂聯素(APDN)、血管緊張素(Ang)Ⅱ和大血管細胞內Ca2+濃度等指標的觀察，探討通絡玉液湯干預DM大鼠大血管纖維化的影響機制，揭示通絡玉液湯對DM大血管的保護作用，為DM的防治提供線索。

1 材料與方法

1.1實驗藥物和試劑 通絡玉液湯組成為生黃芪30 g，生曬參8 g，生山藥20 g，知母10 g，麥冬15 g，花粉10 g，五味子9 g，葛根10 g，雞內金6 g，當歸尾15 g，丹參15 g，地龍8 g，生藥購于滄州同仁堂藥店。按傳統工藝制備水煎，濃縮至含原方生藥量1.7 g/ml的藥液，4℃冰箱保存備用。鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于上海建寧生物科技公司。Ca2+熒光探針(Fluo-3 AM)購于中國碧云天公司。

1.2模型建立與藥物干預 將體重170～190 g清潔級健康雄性SD大鼠72只〔購自天津軍事醫學科學院，編號：SCXX(軍)2009-003〕適應性喂養1 w后，根據預實驗結果，隨機分為正常對照組20只(NC組，4 w、8 w組各10只)和模型組52只。給予模型組高糖高脂飼料(20%蔗糖+10%豬油+2.5%膽固醇+67.5%基礎飼料)喂養4 w后，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(先配制0.1 mmol/L，pH 4.4 的枸櫞酸緩沖液，后在冰水中與STZ 配制成2%的濃度，5 min內用完)，72 h后采大鼠尾靜脈血，隨機血糖大于16.7 mmol/L為DM造模成功，持續高糖高脂飼料喂養6 w，即成為DM血管病變模型(造模成功47只，成功率約90%)。NC組一直采用普通飼料喂養，腹腔注射相同劑量濃度的檸檬酸鈉緩沖液。將模型組大鼠隨機分為DM組23只(4 w組11只、8 w組12只)和通絡玉液湯組24只(TYD組，4 w、8 w組各12只)，通絡液湯組按照人鼠等效劑量給予通絡玉液湯煎劑17 g/(kg·d)灌胃；NC組和DM組每日給予相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.3APDN、AngⅡ、血糖、血脂和細胞內Ca2+濃度檢測 大鼠禁食12 h后，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，采頸總動脈血液，取其中的4 ml分離血清，雙抗體夾心ELISA檢測血清APDN和AngⅡ含量；其余血液用于檢測血糖(強生快速血糖儀)和血脂(奧林巴斯 AU400 全自動生化分析儀)。經處理后腹主動脈平滑肌細胞，采用熒光探針Fluo-3 AM標記法在流式細胞儀488 nm激發波長下檢測細胞內Ca2+濃度。

1.4腹主動脈血管形態學檢查 大鼠處死后迅速切取腹主動脈血管，制成1 mm3小塊，先后用4%戊二醛和1%鋨酸固定，制作超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色后用透射電鏡(Philips CM12)觀察動脈血管的微細結構；另取一部分腹主動脈血管用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察動脈血管的病理變化。

1.5統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組血糖、血脂檢測結果比較 DM 4 w組、8 w組空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯高于同時間NC組(P<0.01)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯低于同時間NC組(P<0.01)；TYD 4 w組、8 w組FBG、TG、TC和LDL-C明顯低于同時間DM組(P<0.01)，HDL-C明顯高于同時間DM組(P<0.01)。見表1。

表1 各組血糖、血脂檢測結果及血清APDN、AngⅡ和大血管平滑肌細胞內Ca2+濃度比較

2.2各組血清APDN、AngⅡ和大血管平滑肌細胞內Ca2+濃度比較 與同時間NC組比較，DM 4 w組、8 w組的APDN明顯偏低，AngⅡ和細胞內Ca2+濃度明顯偏高(P<0.01)；與同時間DM組比較，TYD 4 w組、8 w組的APDN明顯偏高，AngⅡ和細胞內Ca2+濃度明顯偏低，但Ca2+濃度及4 w AngⅡ仍明顯高于NC組(P<0.01)；TYD 4 w組、8 w組間的APDN、AngⅡ和細胞內Ca2+濃度比較無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組大血管形態結構比較 光鏡下觀察(見圖1)：NC 4 w組、8 w組腹主動脈平滑肌細胞未見明顯變形，且排列規則整齊。在DM 4 w組平滑肌細胞存在不同程度的缺失且排列紊亂，少數內皮細胞變性或壞死；DM 8 w組可見大部分平滑肌細胞變性、壞死且排列紊亂，內皮細胞缺失，有脂質沉積，并伴有明顯的炎細胞浸潤。TYD 4 w組可見少量平滑肌細胞變性、壞死且排列較規則整齊，內皮細胞缺失明顯較少，脂質沉積減少，炎細胞浸潤程度明顯減輕；TYD 8 w組與TYD 4 w組沒有明顯差別。電鏡下觀察(見圖2)：NC 4 w組、8 w組腹主動脈內皮細胞脂質略有腫脹。DM 4 w組內皮細胞脫落，可見胞質碎片，內皮下結締組織腫脹；DM 8 w組內皮細胞表面突起、脫落，胞質內出現吞噬小泡，線粒體空泡化，細胞核不規則，內皮細胞游離面胞質缺損，胞質腫脹。TYD 4 w組內皮細胞局部脫落、細胞質略腫脹，線粒體部分空泡化，核間隙擴張，部分內皮細胞胞質游離面脫落；TYD 8 w組與TYD 4 w組沒有明顯差別。

圖1 各組大鼠大血管光鏡觀察(HE，×400)

圖2 各組大鼠大血管電鏡觀察

3 討 論

大血管病變是DM后期嚴重的并發癥，大血管發生動脈粥樣硬化(AS)、狹窄甚至堵塞造成的缺血會嚴重影響運動功能和生活質量，而血管纖維化是大血管病變發生發展過程中的主要表現形式〔5〕。研究證實APDN是一種具有抗AS、促進血管再生等保護作用的脂肪細胞因子〔6～8〕：APDN可以緩解微血管內皮細胞炎癥、抑制巨噬細胞因子(與AS的形成密切相關)的產生、抑制單核細胞或內皮細胞的黏附和髓樣分化，還可以直接抑制血管細胞黏附分子(VCAM)-1、細胞間黏附分子1和E-選擇蛋白等導致AS的分子；APDN可以通過內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、5腺苷磷酸活化蛋白激酶(AMPK) 和環氧合酶(COX)-2等重要的細胞內信號分子促進血運重建。而 AngⅡ是生物活性最強的效應肽，可促進血管AS形成、刺激血管形成纖維化病變，同時增加血管平滑肌細胞的Ca2+內流，影響大血管的功能〔9～11〕：AngⅡ可以通過產生活性氧、活化基質金屬蛋白酶(MMP)、調節巨噬細胞的吞噬功能而加劇纖維帽的不穩定，進而導致AS斑塊的不穩定；AngⅡ能夠通過誘導轉化生長因子(TGF)-β、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)-1和結締組織生長因子(CTGF)的表達促進血管壁的纖維化；AngⅡ還可以促進血管平滑肌細胞的Ca2+內流和血管收縮，進而影響血管功能。故血清APDN 、AngⅡ是衡量動脈粥樣硬化、血管平滑肌纖維化及功能紊亂的重要標志物。

玉液湯可益氣滋陰、固腎止渴，目前被廣泛用于DM、高血壓等疾病的治療，但目前尚未報道其對DM血管病變的療效；生脈散可治療氣陰兩虛證，近年來也常應用于治療心血管病變〔12〕。鑒于DM血管病變瘀血阻絡、氣陰兩虛的病機，本實驗在玉液湯和生脈散的基礎上加減化裁而成通絡玉液湯，具有行活血通絡、益氣養陰之功效，以達到DM血管損傷的防治作用。

本研究結果顯示，給予通絡玉液湯干預后，糖尿病大鼠血清APDN明顯恢復性升高，血清AngⅡ和腹主動脈平滑肌細胞內Ca2+濃度明顯恢復性降低，FBG、TG、TC、LDL-C降低和HDL-C增高，鏡下發現通絡玉液湯可部分逆轉糖尿病大鼠腹主動脈的纖維化。表明通絡玉液湯可以通過升高血清APDN、降低血清AngⅡ和大血管平滑肌細胞內的Ca2+濃度來減輕大血管發生纖維化、保護糖尿病大血管，從而減緩糖尿病大血管病變的發生和發展。