長鏈非編碼RNA-UCA1通過靶向miR-873調控胃癌細胞增殖、侵襲遷移的分子機制

吳欣 黃鴻菲 姜棟棟

(1濰坊護理職業學院解剖教研室，山東 濰坊 262500；2陽光融和醫院消化內科；3濰坊市中醫院病理科)

胃癌是常見的消化系統中的惡性腫瘤之一，雖然放化療能夠延長患者的生存期，但副作用較明顯，隨著分子生物學技術的發展，在分子水平抑制腫瘤生長的治療方式越來越受到人們關注，眾多靶向藥物為晚期胃癌的治療提供了良好的前景，分子靶向治療已成為一種新興治療手段，在胃癌治療中受到廣泛關注〔1～3〕。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200bp的非編碼RNAs，其異常表達在表觀遺傳學、轉錄和轉錄后水平調節胃癌的發生發展、侵襲、轉移等生物學過程〔4〕。尿路上皮癌胚抗原(UCA)1最初是在膀胱癌中發現的一種長鏈非編碼RNA〔5〕，UCA1在多種腫瘤中高表達，作為癌基因起作用〔6〕，在胃癌的增殖、分化、轉移、多藥耐藥等方面發揮重要的作用〔7〕。研究發現miRNA與胃癌的發生發展密切相關〔8〕。miR-873能抑制人前列腺癌PC3細胞的侵襲〔9〕。miR-873影響肝癌患者生存率，在肝癌細胞中過表達抑制肝癌細胞的侵襲和遷移〔10〕。miR-873-5p可阻滯膀胱癌細胞周期進展，抑制細胞的增殖〔11〕。本研究將探尋LncRNA UCA1通對胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響，分析UCA1和miR-873的靶向關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胃癌細胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細胞系GES-1均購自中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；AceQ qPCR SYBR? Green Mix購自南京vazyme生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；細胞計數試劑盒(CCK)-8購自碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1細胞轉染和分組 胃癌細胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細胞系GES-1常規培養于RPMI 1640培養基中，取對數生長期胃癌細胞SGC-7901，將其分為si-con組(si-con)、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組、si-UCA1+anti-miR-873組。

LncRNA-UCA1干擾序列(siRNA)及陰性對照序列(si-con)分別為：siRNA正義鏈：5′-AAGAGCCGATCAGACAAACAA-3′，反義鏈：5′-UUGUUUGUCUGAUCGGCUCUU-3′；si-con 正義鏈：5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3′；miR-873 mimics正義鏈：5′-GCAGGAACTTGTGAGTCTCCT-3′，反義鏈：5′-AGGAGACTCACAAGTTCCT -3′。

1.2.2qRT-PCR分析UCA1及miR-873表達水平 提取細胞總RNA，合成cDNA后進行qRT-PCR方法擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。UCA1引物序列:上游引物:5′-TTTGCCAGCCTCAGCTTAAT-3′；下游引物:5′-TTGTCCCCATTTTCCATCAT-3′；內參GAPDH：上游引物:5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′;下游引物:5′-GCCTCAAGATCAGCAAT-3′；miR-873上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGGCAGGAACTTGTGAG-3′；下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。

1.2.3CCK-8法測定沉默UCA1、過表達miR-873和抑制表達miR-873逆轉si-UCA1對SGC-7901細胞增殖的影響 分別取si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-873組的對數生長期細胞，消化后接種于96孔板培養，分別于24 h、48 h和72 h加入CCK-8試劑。孵育2 h后檢測490 nm處OD值。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 收集si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-873組細胞，無血清培養，取100 μl接種于 Transwell 小室上層，培養24 h后用結晶紫染色，顯鏡下拍照并計數。侵襲實驗：在Transwell小室上層加入基質膠，其余同遷移操作。

1.2.5熒光素酶報告實驗 構建野生型和突變型基因靶點UCA1的熒光素酶表達載體(WT-UCA1和MUT-UCA1)，將其分別與miR-873和miR-con共轉染，按試劑盒說明書操作檢測熒光素酶活性。

1.3統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1胃癌細胞SGC-7901中miR-873和UCA1的表達 SGC-7901細胞中miR-873的表達水平顯著低于GES-1細胞；而UCA1 mRNA的表達水平顯著高于GES-1細胞(P<0.05)，見表1。

表1 檢測胃癌細胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細胞系GES-1中miR-873和UCA1的表達

2.2沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901增殖 與si-con組細胞相比，si-UCA1組SGC-7901細胞中UCA1 mRNA的表達水平顯著下降，SGC-7901細胞活性顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901增殖

2.3沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901遷移和侵襲 si-UCA1組胃癌細胞SGC-7901的遷移和侵襲數量顯著低于si-con組(P<0.05)，見圖1，表3。

圖1 Transwell檢測胃癌細胞SGC-7901遷移數和侵襲數(結晶紫染色，×200)

表3 沉默UCA1的表達抑制胃癌細胞SGC-7901遷移和侵襲個)

2.4UCA1靶向調控miR-873的表達 TargetScan預測顯示UCA1與miR-873存在結合位點(圖2)。轉染miR-873和WT-UCA1后的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而miR-873和MUT-UCA1的細胞熒光素酶活性差異不顯著。見表4。抑制UCA1表達后miR-873的表達水平升高(si-con組0.38±0.05，si-UCA1組1.69±0.13，P<0.05)；而過表達UCA1后miR-873的表達水平降低(pcDNA組0.41±0.05、pcDNA-UCA1組0.16±0.03，P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖2 UCA1靶向調控miR-873的序列信息

2.5過表達miR-873抑制胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲 與miR-con組比較，miR-873組胃癌細胞中miR-873的表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，胃癌細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)，見表5。

表5 過表達miR-873抑制胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲

2.6抑制miR-873表達逆轉了沉默UCA1對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲的影響 與si-con組比較，si-UCA1組miR-873的表達水平顯著升高，SGC-7901細胞活性顯著降低，SGC-7901細胞遷多和侵襲數顯著降低(P<0.05)；與si-UCA1+anti-miR-con組比較，si-UCA1+anti-miR-873組SGC-7901細胞活性顯著升高，SGC-7901細胞遷移和侵襲數顯著升高(P<0.05)，見表6。

表6 抑制miR-873表達逆轉了沉默UCA1對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

LncRNAs的發現對胃癌發病的分子機制研究及發現新的分子標志物提供了可能〔12〕。研究發現UCA1在多種消化系統腫瘤的發生、發展過程中發揮著關鍵作用〔13〕。LncRNA UCA1在胃癌耐藥細胞中顯著高表達，干擾UCA1表達可明顯逆轉胃癌耐藥性，可作為治療胃癌耐藥的重要分子靶標〔14〕。UCA1在腫瘤組織中高表達，下調UCA1表達可明顯抑制胃癌細胞增殖〔15〕。UCA1通過調控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN)1B和細胞分裂周期25磷酸酶(CDC25)B改變細胞周期分布從而影響細胞增殖；通過調控腫瘤蛋白(TP)53和磷酸化蛋白激酶(p-AKT)影響胃癌細胞增殖和遷移，通過結合 miR-143調控人腺激肽釋放酶(HK)2表達影響胃癌細胞糖代謝過程〔16〕。本實驗結果表明抑制UCA1表達可抑制SGC-7901細胞增殖、遷移和侵襲；與上述研究結果一致。

研究報道，miR-873-5p在胃癌組織中低表達，過表達miR-873-5p通過靶向負調控膠質瘤相關瘤基因(Gli)1降低細胞活力，增加細胞凋亡和細胞周期停滯，在胃癌中起腫瘤抑制劑的作用〔17〕。miR-873-5p高表達可抑制阿爾茨海默病中神經細胞凋亡〔18〕。生長停滯特異性轉錄本(GAS)5可通過與miR-873的相互作用抑制HIV-1復制〔19〕。miR-873通過靶向腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)5和轉化生長因子β活化激酶結合蛋白(TAB)1抑制結直腸癌細胞增殖〔20〕。miR-873通過靶向GLI1抑制H9C2心肌細胞增殖〔21〕。miR-873可通過抑制分化的胚胎軟骨細胞表達基因(DEC)2的表達抑制食管癌的進展〔22〕。本實驗結果表明，胃癌細胞中miR-873低表達；過表達miR-873可降低胃癌細胞活性，減少遷移和侵襲數。

UCA1是胃癌細胞中的促癌因子，UCA1能夠下調miR-27b表達從而增強胃癌多藥耐藥性〔23〕。UCA1通過靶向miR-122促進膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲〔24〕。UCA1通過調節miR-96/叉頭轉錄因子(FOXO)3影響胰腺癌的細胞增殖，侵襲和遷移〔25〕。UCA1可靶向調節mi-R143調控前列腺癌細胞的增殖和凋亡〔26〕。UCA1通過miR-184影響青蒿琥酯對前列腺癌細胞增殖和遷移的抑制作用〔27〕。UCA1可與miR-507相結合參與黑素瘤的細胞增殖，侵襲和G0/G1細胞周期停滯〔28〕。而UCA1與miR-873之間的靶向機制還未明確，本實驗結果表明，UCA1可靶向調控miR-873的表達，抑制miR-873表達可逆轉抑制UCA1對胃癌細胞SGC-7901的作用。