草果知母湯介導(dǎo)mTOR信號(hào)通路對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元自噬與凋亡的影響

張高煉 郭建輝 曾敬 李敏 陳銳 張曉寧 劉姍姍 梁韡斌

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院仙葫院區(qū)顱腦外科，廣西 南寧 530023)

腦卒中是嚴(yán)重危害我國中老年人群身體健康的重要疾病〔1〕。目前針對(duì)腦卒中的有效治療是治療時(shí)間窗內(nèi)實(shí)施溶栓治療，快速恢復(fù)供血〔2〕。但現(xiàn)階段，我國的醫(yī)療配置尚不完善，城市偏遠(yuǎn)地區(qū)患者往往難以獲得快速溶栓治療，長(zhǎng)時(shí)間缺血后再溶栓可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆損傷〔3,4〕。細(xì)胞自噬是由自噬小泡包裹胞內(nèi)受損細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解的過程〔5〕。細(xì)胞自噬旨于維持細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)，保證內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是機(jī)體對(duì)抗外界刺激自我激活的一種自我保護(hù)過程，但自噬的過度激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。腦缺血初期〔6〕，血氧不足時(shí)，細(xì)胞自噬激活，快速清除受損神經(jīng)元以維持營養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞存活。但隨著病情發(fā)展，一些完整結(jié)構(gòu)細(xì)胞被過度消化和降解，觸發(fā)非凋亡程序性細(xì)胞死亡，降低神經(jīng)元細(xì)胞的存活率〔7〕。草果知母湯記載于《瘟病條辯》，經(jīng)臨床與動(dòng)物研究顯示具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)于神經(jīng)退行性疾病癲癇造成的認(rèn)知功能損傷具有明顯改善作用〔8〕，但對(duì)缺血性腦卒中的治療效果尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)就草果知母湯對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)功能與認(rèn)知功能的影響進(jìn)行研究，為臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 8周齡SD大鼠，雄性，體重220～240 g，50只，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度22～24℃，濕度60%～65%，自由飲食攝水。所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1 w，進(jìn)行腦缺血再灌注造模，次日，大鼠清醒后根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行隨機(jī)分組，分為：假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、草果知母湯組(Decoction組)和草果知母湯+雷帕霉素組(Decoction+Rap組)。其中Decoction組參考臨床使用劑量，將人與大鼠體表面積換算獲得劑量為5 g/kg，灌胃給藥，雷帕霉素劑量為20 mg/kg，腹腔注射。Sham組與I/R組灌胃等體積生理鹽水，每天連續(xù)給藥或者生理鹽水7 d。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和器材 中藥草果知母湯主要成分為草果、知母、厚樸、半夏、黃芩、甘草。所有中藥各取50 g混合，沸水回流提取2次，第1次10倍體積水回流提取2 h，第2次8倍體積水回流提取1.5 h。藥液過濾后合并濃縮至300 ml，即所有生藥濃度為1 g/ml，4℃保存。

雷帕霉素(上海麥克林公司)，戊巴比妥鈉(阿拉丁生物公司)，圓頭尼龍線栓(廣州佳靈生物技術(shù)公司)，2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，美國Sigma公司)，Nissl染色試劑盒(北京百奧萊博科技公司)，TUNEL染色試劑盒(美國Abcam公司)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、自噬效應(yīng)蛋白(Beclini)抗體，微管相關(guān)蛋白(LC3)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，β-肌動(dòng)蛋白(actin)抗體(上海碧云天公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(武漢三鷹生物公司)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Thermo公司)。

1.3腦缺血再灌注造模 所有大鼠使用戊巴比妥鈉完全麻醉(40 mg/kg)。仰臥位固定于手術(shù)板上，頸部消毒備皮，頸部正中左側(cè)3 mm處切口暴露頸動(dòng)脈，鈍性分離出頸總動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，暫時(shí)封閉頸總動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈。頸外動(dòng)脈開口，插入圓頭線栓，沿分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，以線栓圓頭前進(jìn)15 mm為腦缺血造模終點(diǎn)，此時(shí)，線栓完全阻斷頸總動(dòng)脈入腦血流。3 h后，拔出圓頭線栓，恢復(fù)腦區(qū)供血。其中Sham組麻醉后，僅分離出頸動(dòng)脈。次日，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，除Sham組，剔除0分與4分的動(dòng)物，保證30只動(dòng)物手術(shù)后存活。

1.4神經(jīng)功能評(píng)分 以Longa標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。0分：動(dòng)物正常運(yùn)動(dòng)，四肢正常；1分：動(dòng)物正常行走，但提起動(dòng)物后，前肢蜷縮無法伸展；2分：動(dòng)物正常行走但無法直線前行，向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，前肢蜷縮無法伸展；3分：動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為減少，向一側(cè)行走且轉(zhuǎn)小圈；4分：動(dòng)物無法行走，完全癱瘓。

1.5水迷宮測(cè)試 所有動(dòng)物給藥7 d后，進(jìn)行水迷宮測(cè)試，期間持續(xù)給藥。水迷宮裝置為一個(gè)直徑1.8 m的圓形恒溫水池，分為四個(gè)象限。隨機(jī)選一象限中央設(shè)置直徑12 cm的水下平臺(tái)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)共5次，訓(xùn)練4次，測(cè)試1次。訓(xùn)練期間，自池壁將大鼠放入水中，記錄大鼠90 s內(nèi)探索并登上平臺(tái)的路徑與時(shí)間，記為潛伏期。若大鼠90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則記為90 s，引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)，并滯留5 s。測(cè)試期間，撤去平臺(tái)，記錄大鼠首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.6TTC染色 水迷宮測(cè)試結(jié)束后，深度麻醉大鼠，迅速斷頭，取出大腦置于-20℃冰箱中20 min。大腦硬度適于切片時(shí)取出，沿冠狀位將腦組織切成5片并浸入TTC溶液中，37℃水浴避光孵育30 min，結(jié)束后吸出TTC溶液，使用相機(jī)拍攝照片，測(cè)量腦梗死面積。

1.7透射電子顯微鏡組織片制備 取大鼠缺血側(cè)皮層約1 mm×1 mm×1 mm組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，組織在2.5%戊二醛溶液中固定2 h，PBS洗去表面戊二醛后在1%四氧化鋨中后固定處理。使用梯度乙醇與丙酮脫水后進(jìn)行包埋，應(yīng)用超薄切片儀切片(片厚50 nm)，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并拍照記錄。

1.8免疫組化石蠟切片制備 水迷宮測(cè)試結(jié)束后，深度麻醉大鼠。打開胸腔，經(jīng)心尖處插入灌注針，泵注PBS溶液，自心耳流出血液，以流出液體澄清無血色結(jié)束。再以50 ml 4%多聚甲醛灌注，完整的取出大腦，儲(chǔ)存于4%多聚甲醛溶液中。4℃儲(chǔ)存24 h后，使用梯度乙醇進(jìn)行脫水，結(jié)束后，取出腦組織置于乙醇和二甲苯混合溶液中透化，最后石蠟包埋，使用切片機(jī)切成5 μm切片并進(jìn)行下一步操作。

1.9蘇木素-伊紅(HE)染色 取石蠟切片脫蠟至水，使用蘇木素溶液中常溫下反應(yīng)5 min，PBS終止反應(yīng)并清洗切片，再以1%鹽酸酒精分化后的伊紅溶液反應(yīng)30 s，最后進(jìn)行常規(guī)的脫水和透化，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片。

1.10TUNEL染色 取石蠟切片脫蠟至水，高溫、高壓條件下抗原修復(fù)15 min，以4%牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉2 h。將切片浸入50 μl的TUNEL反應(yīng)溶液中，37℃條件下避光反應(yīng)60 min。隨后將50 μl鏈霉親和素耦聯(lián)辣根過氧化物酶(streptavidin-HRP)工作液加入，避光孵育30 min，加入50 μl二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)底物溶液顯色，清洗后用蘇木素于室溫下進(jìn)行復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍片。

1.11Western印跡 取缺血側(cè)皮層、海馬組織，加入裂解液，冰上勻漿后混懸并再裂解30 min，12 000 r/min離心10 min并收集上清液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，沸水使蛋白變性。等量上樣且十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)結(jié)束后，對(duì)膠上蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后以4%BSA溶液封閉2 h。洗凈封閉液后加入一抗并孵育過夜。次日，清洗PVDF膜，加入HRP標(biāo)記二抗。室溫孵育2 h后，使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)液和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色，結(jié)果使用Image J進(jìn)行分析

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行雙因素方差檢驗(yàn)、單因素方差檢驗(yàn)、Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1草果知母湯對(duì)腦卒中大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 腦缺血造模至給藥治療結(jié)束，Sham組10只大鼠全部存活，I/R組死亡2只，Decoction與Decoction+Rap組給藥過程中各死亡1只。水迷宮訓(xùn)練與測(cè)試結(jié)果見表1。隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期均減少，訓(xùn)練第2次開始，與Sham組相比，I/R組與Decoction+Rap組尋找平臺(tái)潛伏期顯著增加(P<0.05)；與I/R組相比，水迷宮訓(xùn)練第3次開始，Decoction組大鼠平臺(tái)尋找潛伏期顯著減少(P<0.05)。水迷宮測(cè)試中，與Sham組相比，I/R組大鼠尋找平臺(tái)時(shí)間顯著增加(P<0.05)，且穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)，而草果知母湯給藥顯著減少了大鼠尋找平臺(tái)時(shí)間(P<0.05)，增加了大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)(P<0.05)。

表1 各組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期與穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.2草果知母湯對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能與缺血側(cè)梗死的影響 如表2所示，I/R組大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)損傷，多數(shù)大鼠表現(xiàn)為行為呆滯，爬行易跌倒；與I/R組相比，草果知母湯治療顯著降低了大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(P<0.05)，多數(shù)大鼠表現(xiàn)為可直線前行；雷帕霉素與草果知母湯共同干預(yù)卻增加了神經(jīng)功能評(píng)分。如表2和圖1所示，Sham組沒有出現(xiàn)任何的神經(jīng)功能損傷，而I/R組大鼠腦中出現(xiàn)大面積梗死；與I/R組相比，Decoction組大鼠腦組織中白色梗死面積顯著減少(P<0.05)，但雷帕霉素的干預(yù)則增加了腦缺血中白色的梗死區(qū)域。

圖1 各組腦組織梗死區(qū)域染色

表2 大鼠腦組織梗死區(qū)域比例量化統(tǒng)計(jì)與神經(jīng)功能評(píng)分

2.3草果知母湯對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元狀態(tài)的影響 如圖2所示，HE染色顯示Sham組中神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞分布層次清晰，細(xì)胞質(zhì)染色較淺且細(xì)胞膜

完整，細(xì)胞飽滿呈橢圓分布。與Sham組相比，I/R組中，神經(jīng)元分布雜亂無章，細(xì)胞質(zhì)染色較深且細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞之間界限模糊且嚴(yán)重萎縮。草果知母湯的干預(yù)則顯著改善了腦中神經(jīng)元狀態(tài)，而雷帕霉素的干預(yù)則造成大鼠腦中細(xì)胞損傷較多。

2.4草果知母湯對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元凋亡的影響 如表3、圖3所示，TUNEL染色顯示與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，而草果知母湯的治療則顯著減少了腦組織中陽性細(xì)胞數(shù)(P<0.05)，但雷帕霉素的干預(yù)則造成腦組織中陽性細(xì)胞數(shù)再次出現(xiàn)增加。

圖3 各組腦組織區(qū)域神經(jīng)元TUNEL染色(×100)

表3 大鼠腦組織中神經(jīng)元TUNEL染色陽性細(xì)胞比例

2.5草果知母湯對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元自噬的影響 如圖4所示，透射電子顯微鏡顯示，Sham組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為完整，自噬小體與溶酶體形成較少；但I(xiàn)/R組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)缺損，部分區(qū)域呈單層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)出現(xiàn)萎縮且部分細(xì)胞器出現(xiàn)腫脹，視野中有大量的自噬小體形成；與I/R組相比，草果知母湯治療顯著改善了細(xì)胞的形態(tài)，減少了自噬小體的形成；但雷帕霉素的干預(yù)卻造成自噬小體增加，導(dǎo)致細(xì)胞中部分細(xì)胞器出現(xiàn)腫脹。

紅色箭頭：自噬小體圖4 各組腦組織區(qū)域神經(jīng)元自噬

2.6草果知母湯對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白的影響 如表4、圖5及圖6所示，與Sham組相比，I/R組腦組織中mTOR蛋白水平表達(dá)顯著增加，而與I/R組相比，草果知母湯顯著增加了腦組織中mTOR蛋白水平(P<0.05)；雷帕霉素作為mTOR抑制劑，減少了腦組織中mTOR表達(dá)。與Sham組相比，腦缺血再灌注增加了Beclin1表達(dá)(P<0.05)，促進(jìn)了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化；與I/R組相比，草果知母湯顯著減少了腦組織中Beclin1與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)(P<0.05)。

圖6 前額皮層組織中mTOR、Beclin1與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)

表4 大鼠腦組織中mTOR、Beclin1與LC3-II/LC3-I表達(dá)

1～4：Sham組，I/R組，Decoction組，Decoction+Rap組；圖6同圖5 海馬組織中mTOR、Beclin1與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)

3 討 論

腦卒中在中醫(yī)理論上屬于“中風(fēng)病”范疇，以猝然昏撲，不省人事，半身不遂，言語不利為病征〔9〕。其病機(jī)為陰陽失調(diào)，氣血逆亂〔10〕。病因?yàn)槎酁轱嬍巢还?jié)、情志失調(diào)、正氣不足及勞倦過度等。《靈柩·刺節(jié)真邪》提出〔11〕：“虛邪偏克于身半，其入深，內(nèi)居營衛(wèi)，營衛(wèi)稍衰，則真氣去，邪氣獨(dú)留，發(fā)為偏枯”，提示營衛(wèi)衰弱，真氣散失，邪氣獨(dú)留是發(fā)病病機(jī)。唐宋以后，易水學(xué)派李東垣表示：“凡人年逾四旬，氣衰之際，因憂喜憤怒傷其氣者，多有此疾”，即正氣不足是腦卒中的關(guān)鍵因素〔12〕。對(duì)此中醫(yī)提出滋陰潛陽、涼血散瘀作為腦卒中治療策略。草果知母湯方中草果溫太陰獨(dú)勝之寒，知母泄陽獨(dú)盛之熱〔13〕，兩者共為君藥；厚樸、半夏行胃氣、化痰濁，佐草果泄中焦之溫蘊(yùn)，同為臣藥；甘草健脾補(bǔ)中，調(diào)和諸藥。全方從脾胃入手，苦辛、寒熱平調(diào)，以恢復(fù)脾胃正氣轉(zhuǎn)樞為要旨，上行正氣，清濁化濕，驅(qū)熱散邪，以達(dá)治病功效。

與中醫(yī)理論上“中風(fēng)病”所定義的“半身不遂，言語不利”表現(xiàn)一致的是腦缺血再灌注后機(jī)體出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷與記憶功能衰退，這些癥狀是臨床溶栓后機(jī)體恢復(fù)的主要障礙，其作用機(jī)制與持續(xù)的自由基損傷，炎癥反應(yīng)增加，神經(jīng)元過度自噬等多種因素相關(guān)〔14,15〕。本研究提示草果知母湯能夠有效改善腦缺血再灌注介導(dǎo)的損傷，其機(jī)制可能與抑制神經(jīng)元過度自噬相關(guān)。

細(xì)胞自噬是一種高度保守的，旨在通過溶酶體途徑對(duì)損傷的細(xì)胞器及錯(cuò)誤蛋白進(jìn)行分解，以保證細(xì)胞自身的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的自我保護(hù)機(jī)制〔16〕。細(xì)胞此時(shí)能夠有效抵御外界刺激，延緩凋亡過程，但過度的細(xì)胞自噬則會(huì)吞噬一些完整的功能性細(xì)胞，造成神經(jīng)元損傷。其中過度自噬的特點(diǎn)是自噬小體增加，線粒體腫脹變形、細(xì)胞空泡化明顯，部分細(xì)胞器腫脹碎裂〔17〕。生理?xiàng)l件下，細(xì)胞自噬處于抑制狀態(tài)，但缺血初期，腦組織缺血缺氧會(huì)造成細(xì)胞自噬小體激活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但長(zhǎng)時(shí)間不干預(yù)會(huì)造成機(jī)體內(nèi)細(xì)胞自噬的過度激活，細(xì)胞自噬增加造成神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果提示草果知母湯改善了I/R造成的大鼠腦中神經(jīng)元損傷。

缺血再灌注過程中，細(xì)胞自噬對(duì)于神經(jīng)元的存活是一把雙刃劍，其激活水平與腦缺血時(shí)間相關(guān)。初期，有效的自噬激活能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活，但隨著病情進(jìn)展，抑制自噬往往能帶來更多收益。Shi等〔18〕研究顯示，腦缺血3～7 d的模型大鼠，其缺血介導(dǎo)的腦損傷在自噬抑制劑3-MA的干預(yù)下能夠得到改善。但Yan等〔19〕研究表明腦缺血再灌注初期，激活自噬能夠有效改善腦缺血再灌注后的損傷。在自噬激活的過程中，Beclin1和LC3是自噬激活的可靠生物標(biāo)記物，其中Beclin1是酵母自噬基因Atg/Vps30的同源基因，其表達(dá)的強(qiáng)度與自噬的激活密切相關(guān)，Beclin1表達(dá)上調(diào)是自噬過程激活的必要條件〔20〕。LC3-Ⅰ為非激活型胞質(zhì)LC3，在水解和脂質(zhì)化過程中變?yōu)榧せ頛C3-Ⅱ，且與自噬小體膜結(jié)合，促進(jìn)自噬小體的形成〔21〕。因此，Beclin1的敲除與抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化將有助于抑制自噬體的加工，減少自噬過程的過度激活。已有研究顯示，雷帕霉素可以上調(diào)Beclin1，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例，促進(jìn)細(xì)胞自噬激活〔22〕。有趣的是，雷帕霉素是mTOR蛋白抑制劑，因此，mTOR蛋白在細(xì)胞自噬中發(fā)揮著負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。研究顯示，mTOR是腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)下游重要的信號(hào)分子，腦缺血時(shí)AMPK激活，進(jìn)而抑制mTOR的磷酸化，造成mTOR與Unc-51樣激酶(Ulk)1的結(jié)合減少，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生〔23〕。但本研究中，長(zhǎng)期的腦缺血再灌注造成細(xì)胞的自噬程序過度激活，而草果知母湯則通過增加mTOR表達(dá)減少了下游Beclin1及LC3-Ⅱ的表達(dá)。

綜上所述，草果知母湯通過激活mTOR，減少下游Beclin1表達(dá)，抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，抑制腦缺血再灌注后的過度自噬，減少神經(jīng)元凋亡，改善大鼠神經(jīng)功能與認(rèn)知功能損傷。