液相色譜串聯質譜法測定保健食品中3種甲基咪唑類物質

王德利，冷佳蔚，姜 俊，胡文紅

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南 250101；2.山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東濟南 250101）

焦糖色素是食品生產中常用的一種黑色著色劑，顏色呈黑褐色，經常用于加入醬油和可樂中的一種用于改變顏色的添加劑[1]，其實焦糖色素也經常被用于以中草藥提取物為原料生產的保健食品劑型中。焦糖色素生產時會產生致癌小分子副產物4-甲基咪唑（4-MI）[2]。根據世界衛生組織研究發現，4-MI在動物生長過程中能誘發動物腫瘤的生長，同時此類小分子化合物也有可能致癌。1-甲基咪唑與2-MI和4-MI互為同分異構體。

保健食品成分復雜含有多種添加劑、植物源性提取成分等，易造成定量不準確，常用的樣品前處理方法有QuEchers法[3]和固相萃取法[4]等。液相色譜方法定量檢測時，基質復雜定性不準確，同時靈敏度不能達到痕量分析的要求，氣相色譜方法在保健食品前處理過程中目標化合物需要進行衍生化，實驗過程復雜耗時較長，光譜方法和電化學方法抗干擾能力差，定性和定量不準確，因此不適合選擇這些方法。目前，對于保健食品中的1-MI、2-MI和4-MI則沒有液相色譜串聯質譜同時檢測的方法和數據。

建立一種液相色譜質譜法測定保健食品中的甲基咪唑類化合物，通過固相萃取凈化方式對保健食品進行處理，3種甲基咪唑類化合物同時進行定量，并結合親水色譜保留模式，對保健食品中3種甲基咪唑類化合物進行分離，串聯質譜法能夠進行定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準物質：北京曼哈格生物科技有限公司；2-甲基咪唑標準物質：上海安譜實驗科技股份有限公司；1-甲基咪唑-氘代內標，2-甲基咪唑-氘代內標，4-甲基咪唑-氘代內標標準物質：加拿大C/D/N ISOTopes 公司；甲醇，乙腈，甲酸銨：色譜純，德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

H-Class超高效液相色譜儀：美國waters公司；SCIEX 5500質譜儀：美國AB SCIEX公司；旋渦混合器：德國艾卡公司；離心機：德國西格瑪公司；氮吹儀：美國Organomation公司。

1.3 標準溶液配制

儲備液配制：稱取3種標準物質10mg，用乙腈溶解定容至10mL，配制成1mg/mL的標準儲備液。

內標儲備液配制：稱取3種內標標準物質10mg，用乙腈溶解并定容至10mL，配制成1mg/mL的內標標準儲備液。

配制標準工作曲線：移取適量標準溶液和1μg/mL同位素內標溶液，配制成10、50、100、200、500ng/mL系列的含50ng/mL內標溶液的標準工作溶液。

1.4 處理方法

稱取2.0g樣品，加100μL 1μg/mL內標液，加入1%三氯乙酸20mL混合均勻，進行超聲提取30min，在離心機8 000r/min高速離心5min后，把離心后的上清液取出放入另一離心管中。準確移取10mL過陽離子固相萃取柱，分別用5mL 2%甲酸淋洗和5mL甲醇各淋洗一次，用10mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，45 ℃氮吹，加1.0mL初始流動相復溶，過膜，上機測定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：BEH HILIC；柱溫：40 ℃；流速：0.3mL/min；體積：2μL；流動相：A為10mmol/L甲酸銨，B為乙腈。梯度程序如表1所示。

表1 流動相梯度程序

1.4.2 質譜條件

質譜離子源：ESI+；檢測方式：MRM監測；氣簾氣：20.0L/h；碰撞氣：8L/h；離子噴霧電壓：5kV；離子源溫度：500 ℃；噴霧氣流速：50L/h；輔助氣流速：50L/h。

2 結果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

保健食品樣品基質比較復雜，為了提高檢測的靈敏度和準確度，選擇使用固相萃取柱進行樣品除去雜質和富集目標物。選擇不同保留機理的4種固相萃取柱C18、MCX、HLB和MAX對3種甲基咪唑類化合物進行回收率試驗，如圖1所示。結果表明在HLB和MAX固相萃取柱上回收率在20%以下，幾乎沒有保留，由于3種甲基咪唑類化合物在酸性溶液中成為陽離子狀態，在HLB和MAX陰離子固相萃取柱上無法保留，導致回收率較低。3種化合物在C18固相萃取柱上回收率不超過60%，說明目標物在C18固相萃取柱上保留能力也比較差，損失嚴重，最終導致定量結果偏差較大。當使用MCX固相萃取柱時回收率能達到90%以上，說明3種甲基咪唑類化合物在酸性溶液中以陽離子存在，因此在MCX陽離子固相萃取柱中目標物能夠以離子作用力保留，因此在進一步的樣品前處理過程中選擇使用MCX固相萃取柱。

圖1 3種甲基咪唑在固相萃取柱中的回收率

2.2 固相萃取柱洗脫條件的優化

考察洗脫溶液甲醇中氨水體積分數對3種甲基咪唑化合物的洗脫能力，結果如圖2所示。從圖2可以看出，氨水比例5%時回收率最高，但當氨水比例繼續增大時，回收率反而有所降低。分析可能是因為當洗脫溶液為堿性時，甲基咪唑類化合物以分子形式存在，能夠從MCX陽離子固相萃取柱上洗脫下來。通過以上分析可以得出選擇體積分數5%氨水作為洗脫溶液最合適。

圖2 洗脫液中氨水比例優化

2.3 色譜分離條件的優化

通過化合物結構分析，3種甲基咪唑類化合物極性較強，適合使用親水性的BEH HILIC色譜柱進行分離，在實際分離3種目標化合物時分離度和色譜峰性都很好，另3種目標物在一種親水的BEH Amide色譜柱上色譜峰有明顯拖尾和色譜峰展寬現象，導致在定量時造成結果偏差較大。親水模式色譜與質譜串聯兼容性更好，對3種甲基咪唑類化合物同時分離效果會更好，靈敏度也將得到極大提高，因此選擇BEH HILIC親水色譜柱進行分離檢測。

2.4 質譜條件的優化

3種甲基咪唑產生m/z 56.1和m/z 42.1的碎片離子。碎片離子分別選擇作為定性與定量離子對，并通過優化質譜參數，使碎片離子響應強度達到最大。經優化后，3種甲基咪唑化合物及同位素內標物關鍵質譜參數如表2所示。

表2 3種甲基咪唑及同位素內標質譜參數

2.5 方法的線性范圍和檢出限

以化合物定量離子與內標定量離子峰面積比值為縱坐標，以標準溶液濃度（ng/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，結果，如表3所示。

表3 3種甲基咪唑線性方程、線性相關系數和檢出限

2.6 方法的回收率和精密度

采用兩種不含3種甲基咪唑類化合物的不同類型保健食品，進行添加回收率和精密度的試驗。保健食品樣品中添加10、50和100μg/kg三濃度水平，計算回收率和相對標準偏差，3種甲基咪唑化合物在不同基質的回收率在95%～106.2%，RSD在2.1%～5.5%。

2.7 實際樣品測定

用本文建立的方法對市場上購買的50批次保健食品樣品進行檢測。其中保健食品中1-MI未檢出，20批次2-MI含量最高為303.7μg/kg，25批次4-MI含量最高為3 510.4μg/kg。通過對比配料表總結出，配料中含有焦糖色素的保健食品有26批次，其中4-MI檢出有25批次，2-MI檢出有20批次。通過檢測結果可以看出含有焦糖色素的檢出率很高，可能是因為在焦糖色素生產過程中產生了焦糖化，生成了有害的副產物甲基咪唑類化合物，可能不同工藝生產的焦糖色素產生的副產物含量也不同，因此保健食品中甲基咪唑類化合物的危害性有待評估。

3 結束語

通過對實驗條件進行優化，最終選擇提取溶液為濃度1%的三氯乙酸，凈化固相萃取柱為MCX，該提取凈化方法能夠提高方法的靈敏度和準確性，選擇BEH HILIC親水模式色譜柱，建立了液相色譜串聯質譜法測定保健食品中1-MI、2-MI和4-MI內標定量分析方法。