CCD聯(lián)合色譜法優(yōu)化燥濕洗劑的提取工藝△

陳曉雙，宋毅，費小凡

四川大學 華西醫(yī)院 臨床藥學部，四川 成都 610041

燥濕洗劑為中藥復方制劑，主要成分包括威靈仙、馬齒莧、黃芩、大黃、黃柏等13味中藥，具有清熱燥濕、殺蟲止癢的功效[1-3]。近年來，燥濕洗劑在臨床上常應用于滲出性皮炎的治療，效果良好。

目前，國內未見關于燥濕洗劑以提高主要活性成分為目的的工藝及質量標準研究的報道。黃芩苷為黃芩的主要活性成分，將黃芩苷作為該制劑的指標性成分，其在黃芩中的質量分數(shù)高達10.11%[4]。黃芩苷具有清熱、抗炎、殺菌等藥理作用[5-7]。本研究以黃芩苷作為指標成分，采用線性回歸的Plackett-Burman (PB)設計和Central Composite設計[8-12]，分析主要影響因素間的交互作用，并聯(lián)合液相色譜法對其成分測定進行方法學考察，優(yōu)化處方提取工藝，提升質量標準，以建立全面的燥濕洗劑提取工藝方法，提高其治療療效，為進一步研究開發(fā)該處方提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AVP型高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；ME203E型電子天平[梅特勒-托利多(Mettler-Toledo)儀器有限公司]；旋轉蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)；SHZ(Ⅲ)型真空水泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；AS3120型超聲清洗機(天津AutoScience儀器有限公司)。

1.2 試藥

黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-200815，純度>99%)；乙醇、三氯甲烷、磷酸均為分析純(成都市科龍化工試劑廠)；甲醇為色譜純(美國Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司)；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷含量測定方法學考察

2.1.1對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷對照品適量，加甲醇使其質量濃度為60 μg·mL-1，即對照品溶液。

2.1.2供試品溶液影響因素單因素考察

2.1.2.1提取方法考察 精密量取3份燥濕洗液(上清液)各2 mL，置于50 mL圓底燒瓶中，加70%乙醇40 mL，分別采取加熱回流提取1 h、超聲處理1 h和浸泡過夜3種方式進行提取，濾過，濾液置于50 mL量瓶中，用70%乙醇多次清洗濾紙和濾渣，并入50 mL量瓶中，定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜進行濾過，得供試品溶液。結果見圖1A。提取方法為加熱回流時，黃芩苷的含量最高。

注：A.不同提取方法；B.不同加熱提取時間；C.不同提取溶劑比例。圖1 不同提取方法、加熱提取時間及提取溶劑對供試品中黃芩苷含量的影響

2.1.2.2加熱時間考察 分別采用1、2、3 h作為加熱時間進行提取，其他操作同2.1.2.1。結果見圖1B。加熱提取時間為1 h時，黃芩苷的含量最高。

2.1.2.3提取溶劑考察 分別采用50%、70%、95%乙醇各40 mL進行提取，其他操作同2.1.2.1。結果見圖1C。提取溶劑為70%乙醇時，黃芩苷的含量最高。

2.1.2.4供試品溶液制備 精密量取燥濕洗劑2 mL，加入70%乙醇40 mL，加熱，冷凝回流提取1 h，濾過，濾液置于50 mL量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜進行過濾，得供試品溶液。

2.1.3色譜條件 色譜柱為Amethyst C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸(47∶53)；流速：1 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：(280±4) nm；進樣量：10 μL。

2.1.4線性關系考察 配制質量濃度分別為21.66、54.15、108.30、216.60、433.20、866.40 μg·mL-1黃芩苷對照品。采用液相色譜方法，進樣量均為10 μL，測定峰面積值。以峰面積值為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，黃芩苷回歸方程為Y=4 703.1X+5 738.7，r=0.999 9。結果表明，質量濃度為0.022～0.866 mg·mL-1，黃芩苷的峰面積值與對照品進樣含量呈良好的線性關系。

2.1.5精密度試驗 精密吸取2.1.1項下黃芩苷對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，重復進樣5次，測定峰面積值，其RSD=0.53%，表明精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗 取供試品分別于0、2、4、6、8、10 h時進樣10 μL，測定峰面積，其RSD=0.78%，表明該供試品溶液在10 h內黃芩苷含量變化不大，說明10 h內該樣品保持穩(wěn)定。

2.1.7重復性試驗 精密量取同一燥濕洗劑樣品，按供試品配制方法進行制備，制得5份供試品樣品。精密吸取供試品溶液及上述對照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀中，按2.1.3色譜條件連續(xù)進樣，分別測定黃芩苷含量，并計算其RSD=1.11%，表明該方法的重復性良好。

2.1.8加樣回收率試驗 分別精密量取已測定含量的供試品6份，每份1 mL，分別置6個圓底瓶中，精密加入質量濃度為0.405 mg·mL-1黃芩苷對照品溶液1.0 mL，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件，制備加樣回收供試品溶液并注入高效液相色譜儀中，測定黃芩苷含量，RSD=1.83%。表明本方法具有良好的回收率。

2.2 PB設計優(yōu)化提取工藝

通過PB試驗篩選燥濕洗劑工藝中的最顯著影響因素，通過引入粉碎粒度(A)、浸泡時間(B)、料液比(C)、提取次數(shù)(D)、提取時間(E)5個影響因素，根據(jù)前期單因素篩選出的各因素水平范圍，按照高效液相色譜法(HPLC)對不同組別中黃芩苷含量進行平行測定，綜合考察這5個因素對燥濕洗劑中黃芩苷含量的影響。選用n=12的PB設計，每個因素取高(+)、低(-)2個水平。PB設計中，為了方差分析和估計試驗誤差，一般可增加1～3個虛擬變量，為保證誤差估計的可信度，該設計表中增加了F、G、H 3個空白因素。利用Design Expert試驗設計軟件，設計PB試驗，并對其結果進行分析(表1)。

表1 PB設計篩選燥濕洗劑的不同影響因素和水平

設計分組及結果見表2，因素效應分析評價見表3。表2所示，12次試驗中，A～E的5個因素高(+)、低(-)水平分別出現(xiàn)了6次，當某個因子處于高水平時，其余因子各出現(xiàn)高、低水平各3次，通過計算這個因素在高、低水平時試驗響應的均值并求兩均值之差就可得到此因素的效應，其中F～H空項效應的均方和為標準差估計值。空項效應對應的標準差值均較小，說明該試驗產(chǎn)生的隨機誤差較小。表3中模型的P值為0.005 4，P<0.05，說明該模型具有顯著性。表3中F值的大小表明，料液比>提取次數(shù)>提取時間，故對黃芩苷含量影響最大的3個因素分別是料液比、提取次數(shù)和提取時間。選取這3個因素進行后續(xù)CCD試驗。

表2 PB設計篩選燥濕洗劑不同影響因素的結果

表3 PB設計篩選燥濕洗劑不同影響因素的方差分析結果

2.3 響應面法優(yōu)化提取工藝試驗

綜合PB試驗和單因素影響試驗結果，篩選出影響最顯著的3個因子，即料液比(X1)、提取時間(X2)和提取次數(shù)(X3)，利用Design-Expert 8.0.5b軟件進行CCD響應面設計，采用3因素3水平，中心點重復6次，共運行試驗20次，試驗設計與結果見表4～5，方差分析結果見表6。

表4 響應面設計燥濕洗劑中顯著影響因素及水平

表5 燥濕洗劑中顯著影響因素的響應面設計及其黃芩苷含量

表6 燥濕洗劑中顯著影響因素的響應面結果及方差分析結果

將因變量與另外兩因素擬合為三維立體作用圖和預測圖，結果見圖2。響應面曲面圖是對各因素與兩兩因素的交互作用的最直觀的反應，提取時間對燥濕洗劑黃芩苷含量影響最大，其次為料液比，提取次數(shù)影響最小。提取時間與料液比的交互作用對燥濕洗劑提取效果影響最大，其次為提取次數(shù)與料液比的交互作用，提取時間與提取次數(shù)的交互作用最不顯著。

圖2 提取時間、提取次數(shù)、料液比對燥濕洗劑提取效果的響應面三維效應面圖

根據(jù)Design-Expert 8.0.5b軟件優(yōu)化燥濕洗劑最佳提取工藝條件為提取時間60 min、提取數(shù)2次、料液比1∶10。

2.4 驗證實驗

根據(jù)Design Expert 8.05b軟件優(yōu)化出最佳提取工藝：粉碎粒度為細碎，浸泡時間為60 min，料液比為1∶10，提取時間為60 min，提取數(shù)為2次。為了檢驗結果的可靠性，精密平行稱定5份按上述優(yōu)化工藝進行實驗，測定黃芩中黃芩苷質量濃度分別1.156 8、1.229 4、1.165 4、1.186 8、1.179 7 mg·mL-1，平均質量濃度為1.183 6 mg·mL-1，與響應面法預測值1.204 2 mg·mL-1的相對誤差為1.70%，說明驗證值與回歸方程預測值吻合較好，優(yōu)化后的燥濕洗劑提取工藝對進一步生產(chǎn)具有一定的指導意義。

3 討論

在影響燥濕洗劑提取工藝的各因素中，為篩選多因素對黃芩苷主要藥效成分表達量的影響，前期通過單因素試驗，對藥材粉碎粒度、浸泡時間、料液比、提取時間和提取次數(shù)進行初步篩選。結果顯示，以燥濕洗劑中黃芩苷含量為指標，不同影響因素的最佳表達水平：粉碎粒度為細碎(1～6 mm)、浸泡時間為60 min、料液比為1∶10、提取1 h、共提取2次。進而在初步篩選的范圍基礎上，通過PB試驗，同時對多個因素進行交互作用分析，根據(jù)F值大小，篩選具有顯著性的關鍵因素，結果顯示，影響燥濕洗劑中黃芩苷含量最主要的3個影響因素為料液比、提取時間和提取次數(shù)。將這3個主要影響因素進行響應面分析，通過CCD試驗，觀察各影響因素間的交互作用及燥濕洗劑提取工藝中的最佳工藝和表達量。分析結果表明，燥濕洗劑最優(yōu)提取工藝為料液比為1∶10，提取時間為60 min，提取次數(shù)為2次，每100 mL燥濕洗劑中黃芩苷的量最高，提取效果最好，優(yōu)于單因素優(yōu)化結果。在燥濕洗劑提取工藝優(yōu)化過程中，采用PB設計、響應面設計方法，比傳統(tǒng)的正交試驗更為精確和快捷，通過求解線性回歸方程模型，可以預測出最佳的工藝條件，具有精度高、模型預測好的優(yōu)點。

綜合單因素試驗、PB試驗和響應面試驗結果，得到燥濕洗劑的最佳提取工藝：以水為提取劑，粉碎粒度為細碎，提取前浸泡60 min，料液比為1∶10，提取1 h，共提取2次，燥濕洗劑中黃芩苷質量濃度可達1.183 6 mg·mL-1。綜合分析單因素試驗、PB試驗及CCD試驗結果，采用該方法能夠對燥濕洗劑提取工藝進行優(yōu)化，并提高有效成分的含量，該方法能夠為燥濕洗劑的綜合開發(fā)利用提供參考。