基于經(jīng)典方桔梗湯的桔梗-甘草藥對配伍研究△

汪聰聰，張玉玲，耿文潔，桂雙英，彭代銀，王舉濤，2*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012

藥對是臨床上常用且相對固定的2味藥或3味藥之間配伍形式。藥對配伍組成多具有一定規(guī)律，研究藥對配伍有助于揭示中醫(yī)方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵，具有指導(dǎo)醫(yī)生和藥師臨床用藥的意義[1-3]。桔梗-甘草為中藥臨床常用藥對，該藥對經(jīng)加味可演化為清金化痰湯、托里消毒散、清肺湯等經(jīng)典名方。桔梗-甘草藥對最早來源于中醫(yī)經(jīng)典《傷寒論》[4]中的桔梗湯，桔梗湯僅由桔梗、甘草2味藥組成，在臨床上主要用于治療肺熱咽痛、肺熱咳嗽、肺癰[5-7]等證。呂建軍等[8]通過查找《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》中含桔梗-甘草藥對的所有成方制劑，共收集到含桔梗-甘草藥對成方制劑315首，主治證候89種，主治疾病88種。吳嘉瑞等[9]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析桔梗-甘草藥對作用機(jī)制，初步驗(yàn)證了該藥對的基本藥理學(xué)作用和相關(guān)機(jī)制。從以上文獻(xiàn)中可以了解到，桔梗-甘草配伍比例不同，功效主治有所差異，化學(xué)成分含量也可能存在差異。故本實(shí)驗(yàn)通過固定甘草的量，增加桔梗，選定5組桔梗甘草配伍比例(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)，探討不同配伍比例對甘草有效成分溶出的影響。

現(xiàn)代藥理研究表明，桔梗-甘草配伍可協(xié)同增強(qiáng)抗炎功效[10-11]，桔梗湯之所以能發(fā)揮這些功效，與其所特有的抗炎物質(zhì)是密切相關(guān)的[12-13]。為進(jìn)一步證明桔梗-甘草配伍對有效成分溶出的促進(jìn)作用具有普遍性，采用不同產(chǎn)地桔梗[14-16]配伍甘草，考察配伍后桔梗皂苷D、甘草苷與甘草酸的含量變化。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國)有限公司]；LC-10A型高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理(中國)有限公司]；Tabitha RSZG C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；KQ 2200型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；AUW 220型分析天平(株式會社島津制作所)；800 Y型旭曼多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 試藥

色譜純甲醇、乙腈(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；分析純甲醇、乙醚、甲酸(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；對照品甘草苷(純度≥93.1%，批號：111610-201607)、甘草酸銨(純度≥93.0%，批號：110731-201619)購自中國食品藥品檢定研究院；對照品桔梗皂苷D(純度≥99.81%，批號：MUST-17032902)購自成都曼斯特生物科技有限公司。

甘草飲片購自定西隴西縣，桔梗飲片購自運(yùn)城絳縣、亳州譙城區(qū)、商洛商州區(qū)、赤峰喀喇沁旗、阜陽太和縣。由安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山副教授鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFich.的干燥根和根莖、桔梗科桔梗屬植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A.DC.的干燥根。留樣均保存于安徽中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 配伍比例考察

2.1.1對照品溶液制備 精密稱定甘草苷1.99 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，精密量取1 mL于10 mL量瓶中，加入精密稱定的甘草酸銨2.09 mg，加甲醇定容即得甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液。

精密稱定桔梗皂苷D 2.79 mg于5 mL量瓶中，加甲醇定容即得。

2.1.2供試品溶液制備 將甘草飲片量固定為24 g，桔梗分別取8、12、24、48、72 g，按桔梗-甘草1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1配伍，分別用15倍水浸泡，煮沸后文火保持煎液微沸30 min，趁熱過80目紗布，濃縮蒸干，置于烘箱中，烘至干膏，待用。根據(jù)出膏率(表1)，固定甘草飲片量取干膏，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，將量瓶置于超聲清洗儀(250 W，40 kHz)中超聲提取20 min，取出冷卻，加甲醇補(bǔ)足損失的量，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

表1 不同配比桔梗-甘草煎液出膏率及干膏取樣量(n=3)

2.1.3色譜條件 色譜柱：Tabitha RSZG C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫0～10 min，10%～15%B；10～20 min，15%～20%B；20～30 min，20%～30%B；30～50 min，30%～40%B；50～60 min，40%～50%B；60～70 min，50%～55%B；70～80 min，55%～60%B；80～90 min，60%～10%B；90～97 min，10%B)；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

2.1.4重復(fù)性試驗(yàn) 取桔梗-甘草1∶2配伍比例的藥材干膏，按2.1.2項(xiàng)下所述方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各對照品峰面積，計(jì)算供試品中甘草苷和甘草酸含量均值分別為2.50、8.79 mg·mL-1RSD分別為1.55%、2.09%，表明本法重復(fù)性良好。

2.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取桔梗-甘草1∶2配伍比例的干膏，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫下放置0、4、8、12、24 h，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各對照品峰面積，計(jì)算各對照品峰面積的RSD分別為2.31%、1.45%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6精密度試驗(yàn) 取比桔梗-甘草1∶2配伍比例的干膏，按2.1.2項(xiàng)下方法制備1份，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各對照品峰面積，計(jì)算各對照品峰面積RSD分別為2.10%、1.97%，說明儀器精密度較好。

2.1.7線性關(guān)系考察 精密稱量甘草苷對照品，制成質(zhì)量濃度分別為0.977 50、0.488 78、0.244 39、0.122 19、0.610 00 mg·mL-1的對照品溶液；精密稱量甘草酸銨對照品，制成質(zhì)量濃度分別為0.981 89、0.490 95、0.245 47、0.122 74、0、613 70 mg·mL-1的對照品溶液。濾液在2.1.3項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品質(zhì)量濃度(X)對測得的峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，甘草苷、甘草酸銨在0.06～1.00 mg·mL-1線性關(guān)系良好，甘草苷回歸方程為Y=8 333 301.30X-273 360.99(r=0.998 8)，甘草酸銨回歸方程為Y=9 815 481.30X-344 854.94(r=0.998 6)。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn) 取桔梗-甘草1∶2配伍比例的干膏，共12份，其中6份分別加入0.5 mg·mL-1甘草苷對照品溶液1 mL；另外6份分別加入1.8 mg·mL-1甘草酸銨對照品溶液1 mL，按2.1.2項(xiàng)下方法制備并檢測甘草苷和甘草酸的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 甘草苷、甘草酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.1.9不同配伍比例桔梗-甘草中甘草活性成分的含量變化 根據(jù)2.1.2項(xiàng)下方法分別制備各比例的桔梗-甘草(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)供試品溶液，按照2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖并計(jì)算不同比例配伍的桔梗-甘草藥對中甘草苷、甘草酸的含量，重復(fù)操作3次，計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 不同配比桔梗-甘草煎液中2種成分含量(n=3) mg·g-1

根據(jù)表3、圖1，在固定甘草飲片量下，隨著桔梗占比增大(1∶3、1∶2)，甘草苷與甘草酸含量有所增加，但隨著桔梗占比繼續(xù)增大，甘草苷與甘草酸含量不再增加，甚至出現(xiàn)減少情況。且從中可以發(fā)現(xiàn)桔梗-甘草比例為1∶2時含量最高，與《傷寒論》中桔梗湯比例吻合，具有一定理論意義。

圖1 不同配伍比例桔梗-甘草煎液中甘草苷、甘草酸含量折線圖

2.2 不同產(chǎn)地桔梗配伍甘草含量測定

2.2.1單味供試品溶液制備 甘草供試品溶液：取甘草12 g，約加水600 mL浸泡，煮沸后保持煎液微沸，煎煮濃縮約至200 mL。趁熱過80目紗布，濃縮蒸干，置于烘箱中，烘至干膏，待用。稱取干膏約0.66 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，將量瓶置于超聲清洗儀(250 W，40 kHz)中超聲提取20 min，取出冷卻，加甲醇補(bǔ)足損失的量，取清液過0.22 μm微孔濾膜，即得甘草供試品溶液。

桔梗供試品溶液：取購于運(yùn)城絳縣、亳州譙城區(qū)、商洛商州區(qū)、赤峰喀喇沁旗、阜陽太和縣桔梗各6 g，約加水600 mL浸泡，煮沸后保持煎液微沸，煎煮濃縮約至200 mL。趁熱過80目紗布，濃縮蒸干，置于烘箱中，烘至干膏，待用。取干膏0.33 g于錐形瓶，精密移取水飽和正丁醇30.00 mL，超聲至完全溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，精密量取稀氨水20 mL洗滌正丁醇液3次，將洗滌后的正丁醇液置于蒸發(fā)皿中于水浴鍋上方蒸干，加入甲醇溶解，定容于2 mL量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2.2.2復(fù)方供試品溶液制備 將甘草分別與運(yùn)城絳縣、亳州譙城區(qū)、商洛商州區(qū)、赤峰喀喇沁旗、阜陽太和縣5個產(chǎn)地桔梗(1∶2)配伍，約加水600 mL浸泡，煮沸后保持煎液微沸，煎煮濃縮約至200 mL。趁熱過80目紗布，濃縮蒸干，置于烘箱中，烘至干膏，待用。1)精密稱取各產(chǎn)地配伍復(fù)方干膏1.0 g，同2.2.1中供試品溶液制備方法，制得各產(chǎn)地配伍復(fù)方甘草含量測定樣品。2)精密稱取各產(chǎn)地配伍復(fù)方干膏1.0 g，同2.2.1中供試品溶液制備方法，制得各產(chǎn)地配伍復(fù)方桔梗含量測定樣品。

2.2.3色譜條件 甘草苷、甘草酸銨含量測定色譜條件同2.1.3項(xiàng)下色譜條件。

桔梗皂苷D含量測定色譜條件：色譜柱選用Tabitha RSZG C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1%甲酸(73%)-乙腈(27%)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)：漂移管溫度為60 ℃，載氣流速為1.20 L·min-1。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn) 取阜陽太和縣桔梗-甘草干膏，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件測定，記錄桔梗皂苷D對照品峰面積，計(jì)算含量RSD為0.80%，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取阜陽太和縣桔梗-甘草干膏，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，在室溫下放置0、4、8、12、24 h，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件測定，記錄桔梗皂苷D對照品峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為2.19%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6精密度試驗(yàn) 取阜陽太和桔梗-甘草干膏，按2.2.2項(xiàng)下方法制備1份，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件測定，記錄桔梗皂苷D對照品峰面積，計(jì)算峰面積RSD為2.54%，說明儀器精密度良好。

2.2.7線性關(guān)系考察 精密稱量桔梗皂苷D對照品，制成質(zhì)量濃度分別為0.990 00、0.495 00、0.247 50、0.123 75、0.061 87 mg·mL-1的對照品溶液，過0.22 μm 微孔濾膜，濾液在2.2.3項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品質(zhì)量濃度為X，以對照品峰面積為Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，桔梗皂苷D在0.06～1.00 mg·mL-1線性關(guān)系良好，得到線性回歸方程為Y=1.595 3X+4.132 5，r=0.999 4。

2.2.8加樣回收試驗(yàn) 取阜陽太和縣桔梗-甘草干膏，共6份，分別加入0.6 mg·mL-1桔梗皂苷D 1 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 桔梗皂苷D加樣回收率試驗(yàn)

2.2.9不同產(chǎn)地桔梗配伍甘草3種成分含量測定 根據(jù)2.2.1項(xiàng)下方法分別制備單味桔梗、單味甘草供試品溶液，按照2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖(圖2～3)并計(jì)算桔梗皂苷D、甘草苷、甘草酸3個成分的含量，重復(fù)操作3次，計(jì)算結(jié)果見表5。

注：A.甘草苷與甘草酸銨混合對照品；B.單味桔梗；C.單味甘草；D.桔梗湯；1.甘草苷；2.甘草酸。圖2 甘草苷、甘草酸銨含量測定條件下對照品、單味對照品及復(fù)方圖譜

注：A.桔梗皂苷D對照品；B.單味桔梗；C.單味甘草；D.桔梗湯。圖3 桔梗皂苷D含量測定條件下對照品、單味對照品及復(fù)方圖譜

表5 不同產(chǎn)地甘草、桔梗配伍含量測定結(jié)果(n=3) mg·g-1

表5結(jié)果表明，5個桔梗產(chǎn)地均顯示桔梗甘草配伍后桔梗皂苷D、甘草苷和甘草酸含量均較單味藥材中含量有所增加，其中以赤峰喀喇沁旗產(chǎn)地的桔梗-甘草配伍組桔梗皂苷的含量最高，其次為阜陽太和縣與亳州區(qū)譙城產(chǎn)桔梗。

3 討論

由于桔梗皂苷D成分呈紫外末端吸收，高效液相色譜-紫外檢測器(HPLC-UV)檢測時流動相溶劑干擾嚴(yán)重，基線較不穩(wěn)定；ELSD是一種通用型檢測器[17-19]，尤其適用于沒有紫外吸收或末端吸收的成分，其靈敏度、穩(wěn)定性以及重復(fù)性均能符合含量測定的要求，所以采用HPLC-ELSD測定桔梗皂苷D的含量更為準(zhǔn)確可靠。

桔梗-甘草研究最優(yōu)比例為1∶2，與本課題前期工藝研究[20]中選用《傷寒論》中配比相吻合，有利于前后研究相互印證。考察不同產(chǎn)地桔梗藥材配伍甘草對復(fù)方桔梗湯指標(biāo)性活性成分含量變化的影響，驗(yàn)證該配伍比例的普遍性。藥對的方法多樣、研究角度也很多，本實(shí)驗(yàn)從不同配伍比例有效成分溶出量的變化角度開展，后續(xù)需要質(zhì)譜、核磁共振等分析手段進(jìn)一步辨析，同時也還需要藥理、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

目前，對于桔梗-甘草藥對配伍后的新的化學(xué)成分變化研究并不深入，這可以作為未來研究的一個方向。桔梗-甘草藥對配伍后的療效得到一致認(rèn)可，在臨床上的應(yīng)用也較為廣泛，相信隨著桔梗-甘草藥對研究工作的不斷開展，對這一經(jīng)典方的認(rèn)識會達(dá)到新的高度，從而為傳統(tǒng)中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供參考。