基于網絡藥理學的丹參治療視網膜靜脈阻塞作用機制研究△

劉自強，農璐琪，韓夢雨，訾迎新，孟歡，鄧宇，鄧婷婷，金明*

1.北京中醫藥大學，北京 102488；2.中日友好醫院 眼科，北京 100029

視網膜靜脈阻塞(RVO)是指視網膜靜脈血液循環發生障礙，引起視網膜相應區域出血、滲出及水腫的眼病[1]，其并發癥黃斑水腫能引起患者視力下降甚至導致失明。RVO癥狀與中醫“暴盲”“視瞻昏渺”類似。目前多數醫家認為，RVO主要是由各種原因導致的脈絡瘀阻、血行不暢而溢于脈外、遮蔽神光所致[2]。

丹參為植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的根及根莖，其主要功效為活血祛瘀、止痛等，臨床上常用于治療胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、月經不調等疾病[3-4]。丹參目前是眼科臨床上常用的活血化瘀藥，對RVO有一定的治療作用。樊曦等[5]研究發現，丹參聯合三七口服給藥后，可明顯降低RVO模型大鼠血小板黏附率，預防視網膜靜脈血栓形成。以丹參為主要成分的中成藥復方血栓通膠囊[6]、丹紅化瘀口服液[7]等也已被證實對RVO有一定治療作用。相關研究發現，使用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液能有改善效視網膜中央靜脈阻塞患者的臨床癥狀和血液流變學相關指標[8-9]。張錫鋼等[10]研究發現，使用丹參注射液離子導入治療早期RVO患者可提高臨床療效。然而，目前丹參治療RVO的作用機制尚不明確，且中藥有效成分復雜，僅通過動物實驗等探究其作用機制存在一定的困難。

網絡藥理學以多學科為基礎，闡明藥物治療疾病的作用靶點和信號通路，這與中藥多成分、多靶點治療疾病類似[11-12]。因此，本研究通過篩選丹參的有效成分及相關疾病靶點，獲得丹參和RVO的交集靶點，構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡和“藥物-有效成分-疾病-靶點”網絡，進行生物學過程和通路分析，以期為臨床使用丹參治療RVO提供參考。

1 材料與方法

1.1 丹參有效成分及靶點的獲取與篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)[13]檢索丹參的有效成分，以藥物口服生物利用度(OB)>30%、類藥性(DL)>0.18及口服藥物Caco-2細胞滲透率>0.4作為篩選條件，獲得丹參的主要有效成分及其相關靶點。

1.2 疾病相關靶點的獲取

應用GeneCards數據庫(https：//www. genecards. org/)，以“retinal vein occlusion”為關鍵詞進行檢索，獲得RVO相關的疾病靶點。將丹參有效成分靶點和RVO靶點取交集，并制作韋恩圖。

1.3 PPI網絡的構建

在STRING 11.0數據庫(https：//string-db.org)構建丹參活性成分靶蛋白和RVO相關靶蛋白的PPI網絡圖。

1.4 藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網絡的構建

應用Cytoscape 3.7.2軟件分析數據，構建藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網絡。

1.5 富集分析

采用ClusterProfiler R軟件對丹參治療RVO的作用靶點進行基因本體(GO)注釋分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析[14]，探討丹參有效化學成分治療RVO的作用機制。

2 結果

2.1 丹參有效成分

在TCSMP數據庫中，將丹參有效成分按OB、DL及Caco-2細胞滲透率條件進行篩選后，最終得出41個有效成分，分別是丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ、丹參新醌等，見表1。獲得丹參有效成分對應靶點70個。

2.2 疾病靶點

通過GeneCards數據庫進行檢索，獲得RVO的疾病靶點1705個，與丹參有效成分靶點的交集靶點46個，使用ClusterProfiler R軟件繪制疾病靶點與藥物成分靶點韋恩圖，見圖1。

2.3 PPI網絡

通過STRING 11.0數據庫構建構建丹參活性成分靶點和RVO相關靶點的PPI網絡，見圖2。

圖2 丹參與RVO靶點的PPI網絡

2.4 藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網絡

使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制丹參治療RVO的藥物-活性成分-疾病-靶點相互作用網絡，見圖3。在該網絡中，共包含節點83個，其中丹參、RVO節點各1個，丹參有效成分節點35個(表1內41個丹參有效成分中，有6個成分無對應的RVO靶點)，丹參治療RVO的潛在作用靶點46個，含邊354條。其中丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ等成分相關的節點數較多，是丹參的主要有效成分。

注：紅色代表RVO；綠色代表丹參；黃色代表丹參治療RVO有效成分；藍色代表交集靶點。圖3 丹參治療RVO的藥物-活性成分-疾病-靶點網絡

2.5 GO功能富集分析

通過ClusterProfiler R軟件對上述獲得的46個關鍵靶點進行GO注釋分析，丹參治療RVO的主要富集過程包括核受體活性、轉錄因子活性、類固醇激素受體、G蛋白偶聯胺受體活性、激活轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、核轉錄因子-κB(NF-κB)結合、血紅素結合、銨離子結合、DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、四吡咯結合、酰胺結合、氧化還原酶活性、類固醇結合、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調節活性、肽結合、腎上腺素能受體活性、神經遞質結合等。其中關鍵靶點(前20位)見圖4。

圖4 丹參治療RVO靶點的GO富集分析(前20位)

2.6 KEGG通路富集分析

借助ClusterProfiler R軟件對丹參與RVO的共同靶點進行KEGG通路富集分析，篩選出作用通路共76條，包括乙型肝炎、麻疹、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、內分泌抵抗、催乳素信號途徑、丙型肝炎、環磷酸腺苷(cAMP)信號通路、人巨細胞病毒感染、細胞凋亡、腫瘤壞死因子信號途徑、弓形蟲病、磷脂腺肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、人T細胞白血病病毒1型感染、利什曼病、糖尿病并發癥中的糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)信號通路、Th17細胞分化、多種凋亡、膽堿能突觸等相關。其中最為顯著的20條代謝通路見圖5。

圖5 丹參治療RVO靶點的KEGG富集分析(前20位)

3 討論

RVO多發生于中老年患者，目前發病機制不完全明確，致使其發生的因素有年齡增長、高血壓、糖尿病、血脂異常、心血管疾病等[15]，并發癥黃斑水腫是引起視力受損的主要原因。中醫認為RVO的病因病機復雜，其發生的根本原因在于脈絡瘀阻、血溢于脈外。早在《證治準繩·雜病·七竅門》中就已提及該病的發病機制，現代學者多認為血瘀是RVO的重要病理基礎。李學晶等[16]認為，RVO基本病機為氣虛血瘀。孟凡超等[17]認為瘀是RVO發病之關鍵，與氣、火、痰交雜致病。

丹參作為中國傳統中藥，具有活血祛瘀、通經止痛之功效，而RVO患者正對此病機。本研究中TCMSP數據庫檢索結果和藥物-有效成分-疾病-靶點網絡分析結果顯示，丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ、丹參新醌等化合物相關的節點數較多，是丹參的主要有效成分。其中，丹參酮ⅡA是目前研究的熱點之一。楊敏[18]發現，丹參酮ⅡA能改善患者血液的纖溶及抗凝活性，降低全血比黏度等水平，從而改善凝血功能及相關血流變指標，血液黏稠度增高是RVO發生的主要危險因素。曹珊等[19]研究發現，丹參酮ⅡA可以降低患者血清中IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子水平，而上述炎性因子在RVO發生發展中發揮重要作用[20]。

丹參治療RVO的PPI網絡分析結果顯示，46個靶蛋白中，節點度值排序前10位的依次為Fos、骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(MYC)、胱天蛋白酶3(CASP3)、雌激素受體1(ESR1)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、髓樣β(A4)前體蛋白(APP)、細胞周期素1(CCND1)、Jun、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、網狀內皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)，可能是丹參治療RVO的關鍵靶點。其中PTGS2、STAT3的表達與炎癥密切相關[21-22]，RELA在調控炎癥的細胞信號系統/NF-κB信號通路中起著極其重要的作用[23]，炎性反應是RVO發生發展的重要環節。Fos、MYC在調控細胞生長、分裂、增殖等方面發揮重要作用，能促進組織的修復和再生，與改善凝血、微循環、血液流變學及血流動力學指標等密切相關[24]。CASP3參與細胞凋亡過程的調控。

本研究發現，丹參治療RVO主要涉及81個生理過程和76條通路。KEGG結果顯示，丹參的主要作用可能與細胞凋亡、TNF信號通路、IL-17信號通路等有關。TNF是機體抗炎和免疫調節的主要細胞因子之一，研究表明，RVO的產生及嚴重程度與房水或玻璃體液中TNF-α水平呈正相關[25]。Wang等[26]發現，TNF-α通過誘導基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達來參與RVO的發生。Yamawaki等[27]發現，TNF-α通過激活血管內皮生長因子來增強炎性反應，促進新生血管生成。IL-17是炎癥反應的早期啟動因子，IL-17與受體結合后，可通過促分裂原活化蛋白激酶途徑和NF-κB途徑發揮其抗炎作用[28]。Li等[29]研究認為，IL-17可能通過細胞骨架重塑、血管內皮生長因子等參與RVO新生血管形成。炎性反應和新生血管形成是RVO發生發展中最為重要的病理反應。

本研究的網絡藥理學分析也存在一定的局限性，首先，丹參有效化學成分的靶蛋白譜廣，加之RVO病理機制復雜，如何通過數學計算在網絡靶標的基礎上準確找到丹參治療RVO的多種靶蛋白及作用途徑，值得進一步探索；其次，目前關于丹參、RVO的數據庫信息及臨床、實驗數據的積累還有很大不足，同時缺乏對活性成分定量檢測，故本次研究僅為預測性分析，后期應進行相關實驗予以驗證[11，30]；最后，網絡藥理學是將復雜生物系統間的相互作用抽象表達為網絡，故還需要從理論和實際應用等方面深入理解丹參治療RVO的內在調控機制[31]。

4 結論

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，分析了丹參與RVO疾病靶點之間的復雜網絡關系，發現丹參可能是通過調控炎癥反應、血管生成、凝血過程和細胞凋亡等發揮對RVO的治療作用，但本研究僅為預測分析，建議后期應注重對預測的靶點和通路進行相關實驗驗證，以期為丹參治療RVO提供更為確切的臨床使用依據。