CD4+效應型記憶T細胞與白細胞介素-6聯合超敏C-反應蛋白對急性缺血性卒中合并肺感染的診斷價值

黃小雨 李鳳展 劉壇 楊婷婷 付琳琳 張勇

急性缺血性卒中是臨床十分常見的神經系統疾病，具有高發病率、高病殘率、高死亡率之特點［1］。肺感染是其常見并發癥，可嚴重影響患者生活質量、增加死亡風險及經濟負擔［2-4］，因此早期預測指標對急性缺血性卒中患者肺感染的預防與管理具有重要意義。CD4+效應型記憶T細胞（CD4+TEM）是記憶T細胞（Tm）之亞群，在炎癥微環境刺激下CD4+TEM細胞表達升高，同時可迅速遷移至外周炎癥部位發揮效應功能，為機體提供免疫記憶保護，有望成為臨床診斷炎癥性疾病的新型生物學標志物［5-7］。目前，國內外關于CD4+TEM細胞診斷急性缺血性卒中肺感染的研究尚屬空白，尤其是在白細胞介素-6（IL-6）和超敏C-反應蛋白（hs-CRP）等炎性指標單獨檢測對早期預測的敏感性與特異性仍有待提高的情況下，對CD4+TEM細胞的研究更是成為不可或缺的課題［8-9］?；诖?，筆者以徐州醫科大學附屬醫院神經內科近年收治的109例急性缺血性卒中患者為觀察對象，以探究其外周血CD4+TEM細胞表達變化，并進一步分析CD4+TEM與IL-6和hs-CRP聯合應用的預測價值。

對象與方法

一、研究對象

1.診斷標準 （1）急性缺血性卒中的診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》之標準［10］，且經頭部CT和（或）MRI確診。（2）肺感染診斷依據2010年公布的《卒中相關性肺炎診治中國專家共識》標準［11］。

2.納入與排除標準 （1）患者發病時間＜48 h。（2）排除發病時間＞48 h；合并有免疫、血液、腫瘤、嚴重心肝腎疾患或生命體征不穩定；近3個月內發生過缺血性卒中、腦出血或罹患消化道、呼吸道、泌尿系、生殖道、皮膚感染等慢性感染性疾病。

3.一般資料 根據上述納入與排除標準，選擇2018年6月至2019年12月于我院神經內科住院治療的急性缺血性卒中患者共109例，男性63例，女性46例；年齡38～93歲，平均（64.15±12.54）歲。既往有吸煙史者占26.61%（29/109）；合并高血壓者占48.62%（53/109）、糖尿病14.68%（16/109）、冠心病12.84%（14/109）；存在吞咽困難占17.43%（19/109）。美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分3～29，平均評分12.22±5.85。以是否合并肺感染為分組標準，分為肺感染組（感染組，54例）和無肺感染組（對照組，55例），兩組一般資料比較，感染組吸煙（P=0.045）、吞咽困難（P=0.021），以及NIHSS評分（P=0.000）等項指標略高于對照組（表1）。

二、研究方法

1.評價指標 （1）流式細胞術檢測CD4+TEM細胞表型：所有患者均于入院第2天晨起空腹抽取外周靜脈血6 ml，其中2 ml以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，余4 ml進行血清分離。采用人淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）通過密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞（PBMC）懸液，磷酸鹽緩沖液洗滌，于離心半徑5 cm、轉速1500 r/min離心5 min，去上清液，磷酸鹽緩沖液重復洗滌，再次離心5 min，去上清液，加入磷酸鹽緩沖液500μl重懸細胞，分別滴加鼠抗人CD3-APC-Cy7、CD4-APC、CD45RA-V450、CD45RO-PE-Cy7、CD62L-PE和CCR7-BV510抗體（美國BD公司），同時設同型對照管，室溫避光孵育15 min，LSRF ortessa型流式細胞儀（美國BD公司）檢測CD4+TEM細胞，檢測表型為CD3+CD4+CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-［12-14］。然后，利用流式設門法分序圈出外周血CD3+T、CD4+T、CD4+記憶T細胞和CD4+TEM細胞，最后獲得CD4+TEM細胞占CD4+記憶T細胞之百分率。（2）其他指標：采用電化學發光（ECL）法檢測血清IL-6、免疫散射比濁法測定hs-CRP水平，采用7171A全自動生化儀檢測血糖、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肝腎功能等項生化指標。

2.統計分析方法 采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行處理與分析。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗；呈非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距［M（P25，P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以相對數構成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗；急性缺血性卒中肺感染的危險因素篩查，采用單因素和多因素前進法Logistic回歸分析（α入=0.05，α出=0.06）；以受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析CD4+TEM細胞百分率，及其與IL-6和hs-CRP聯合應用對急性缺血性卒中肺感染的預測價值，采用MedCalc軟件比較各項影響因素的預測價值。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

結 果

本組患者血清LDL-C水平1.02～6.77 mmol/L，中 位 值 為2.57（1.91，3.12）mmol/L；血 糖 為5.21～12.37 mmol/L，中位值2.57（1.91，3.12）mmol/L；尿素2.10～8.66 mmol/L，平均（5.15±1.33）mmol/L；肌酐40～89 mmol/L，平均（57.26±10.32）mmol/L；IL-6 3.20～25.30 pg/ml，中位值8.50（7.25，12.40）pg/ml；hs-CRP 2.10～39.40 mg/L，中 位 值16.30（8.35，22.15）mg/L。感染組血清IL-6（P=0.000）和hs-CRP（P=0.000）水平高于對照組，但血清LDL-C、血糖、尿素及肌酐水平兩組差異無統計學意義（均P＞0.05，表1）。

表1 感染組與對照組患者一般資料的比較Table 1. Comparison of the baseline data in patients between infection group and control group

流式細胞術顯示，感染組CD4+TEM細胞百分率高于對照組且差異具有統計學意義（P=0.000；表2，圖1）。

圖1 流式細胞術檢測顯示，感染組外周血CD4+T細胞、CD4+記憶T細胞和CD4+TEM細胞數目均高于對照組Figur e 1 Flow cytometry showed peripheral blood CD4+T cells,CD4+memory T cells and CD4+TEM cells in infection group were significantly higner than control group.

表2 感染組與對照組CD4+TEM細胞百分率的比較（x±s，%）Table 2. Comparison of the percentage of CD4+TEM between infection group and control group(x±s,%)

單因素Logistic回歸分析顯示，吞咽困難（P=0.026）、NIHSS評分（P=0.000）增加，以及IL-6（P=0.000）、hs-CRP（P=0.000）和CD4+TEM細胞百分率升高（P=0.000）為急性缺血性卒中肺感染的危險因素（表3，4）。將上述因素代入多因素Logistic回歸方程，結果顯示，CD4+TEM細胞百分率（OR=1.153，

表3 急性缺血性卒中肺感染影響因素的變量賦值表Table 3. Variable assignment of the influenting factors related to pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke

95%CI：1.069～1.244；P=0.000）、IL-6（OR=1.351，95%CI：1.046～1.747；P=0.021）和hs-CRP（OR=1.087，95%CI：1.008～1.172；P=0.021）水平升高是急性缺血性卒中肺感染的危險因素（表5）。

表5 急性缺血性卒中肺感染影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 5. Multivariate Logistic regression analysis of influenting factors of pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke

由ROC曲線分析可見，CD4+TEM細胞百分率、IL-6和hs-CRP曲線下面積分別為0.906（SE=0.028，95%CI：0.850～0.961；P=0.000）、0.799（SE=0.044，95%CI：0.714～0.885；P=0.000）、0.831（SE=0.039，95%CI：0.754～0.908；P=0.000）。當CD4+TEM細胞百分率與IL-6和hs-CRP進行聯合預測時，曲線下面積增至0.943（SE=0.020，95%CI：0.904～0.982；P=0.000，圖2）。利用Med Calc軟件對CD4+TEM細胞百分率、IL-6、hs-CRP單獨檢測，以及三項指標聯合檢測的ROC曲線下面積進行兩兩比較，CD4+TEM細胞百分率單獨預測效果明顯優于IL-6，且差異具有統計學意義（P=0.028），而與hs-CRP之間差異無統計學意義（P=0.083）；三指標聯合預測效果明顯優于IL-6和hs-CRP單獨應用，且差異具有統計學意義（均P=0.000），但與CD4+TEM細胞百分率單獨應用差異無統計學意義（P=0.084，表6）。

圖2 ROC曲線顯示，CD4+TEM細胞百分率、IL-6和hs-CRP單獨檢測，以及三項指標聯合應用預測急性缺血性卒中肺感 染 的 曲 線 下 面 積 分 別 為0.906（95%CI：0.850～0.961）、0.799（95%CI：0.714～0.885）、0.831（95%CI：0.754～0.908），以及0.943（95%CI：0.904～0.982）Figure 2 ROC curve showed the AUC of the percentage of CD4+TEM cells,IL-6,hs-CRP and the combined detection of three indexes in predicting pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke was 0.906(95%CI:0.850-0.961),0.799 (95%CI:0.714-0.885),0.831 (95%CI:0.754-0.908)and 0.943(95%CI:0.904-0.982).

討 論

大量研究業已證實，由外周循環免疫細胞所介導的免疫炎癥反應是急性缺血性卒中并發肺感染的主要原因，CD4+T、CD8+T、調節性T細胞（Treg）和自然殺傷細胞（NK）等免疫細胞均參與其中［9，15-16］。然而，單純根據上述免疫細胞的表達變化診斷急性缺血性卒中肺感染尚難以達到早診斷、早治療的要求，因此尋找新型生物學標志物對提高療效、改善預后有著極其重要的意義。

記憶T細胞是機體免疫防御和抗原清除系統的重要組成部分，可以針對外來及異種抗原迅速產生免疫應答，一直是抗感染和疫苗研制領域頗受關注的T細胞亞群［17］。CD4+TEM細胞是記憶T細胞抵御病原的第一道防線，在感染早期能夠迅速遷移至感染部位發揮效應功能，并可長期在外周血及組織中表達［5］。目前已在結核桿菌或病毒感染等炎癥性疾病患者的外周血中觀察到CD4+TEM表達水平升高，提示該項指標有望成為臨床診斷感染性疾病的新型生物學標志物［18-19］。既往研究證實，急性缺血性卒中患者并發感染與其體內免疫功能紊亂密切相關，其中參與細胞免疫應答的核心成分CD4+T細胞在缺血性卒中患者外周血中的數目明顯減少，而并發肺感染者細胞免疫受抑制現象更為明顯，此與CD4+T細胞接受抗原刺激后發生克隆增殖和分化有關［15-16，20］。在接受抗原刺激后，初始T細胞發生特異性抗原提呈反應，逐漸分化為記憶T細胞；后者具有較大的異質性，根據是否表達CC族趨化因子受體7（CCR7）和白細胞分化抗原62L（CD62L）進一步分為中央型記憶T細胞（TCM）和效應型記憶T細胞（TEM）細胞，其中TEM細胞比初始T細胞和TCM細胞具有更強的抗原識別能力和激活免疫反應性，能夠迅速向炎癥部位趨化，發揮效應功能［13，21］。因此，TEM細胞在一定程度上反映了機體之免疫狀態。本研究首次對急性缺血性卒中合并肺感染患者外周血CD4+TEM細胞百分率進行分析比較，發現感染組患者外周血CD4+TEM細胞表達明顯高于對照組，提示CD4+TEM細胞與急性缺血性卒中肺感染密切相關。

表4 急性缺血性卒中肺感染影響因素的單因素Logistic回歸分析Table 4. Univariate Logistic regression analysis of influenting factors of pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke

對本研究兩組患者一般情況的分析顯示，肺感染組吸煙者所占比例大、NIHSS評分高且大多合并有吞咽困難，而且血清IL-6和hs-CRP水平也明顯高于對照組。經Logistic回歸分析，CD4+TEM細胞百分率、IL-6和hs-CRP水平升高為影響急性缺血性卒中肺感染的重要危險因素，此與既往文獻報道的結果相一致［8，22］。急性缺血性卒中患者在發病早期即可出現外周血IL-6水平升高，當并發感染時，在應激條件下IL-6等炎性因子的表達可進一步升高，且隨著病情的進展不斷上升。IL-6的升高可直接激活巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞，誘導hs-CRP等急性期炎性蛋白合成并擴大炎癥細胞毒性反應，導致組織細胞損傷［8，23］。與IL-6一致，hs-CRP也是機體炎癥狀態下的急性期反應物，有研究顯示，急性缺血性卒中患者發病后其外周血hs-CRP即處于較高水平，并發感染后可使血清hs-CRP進一步升高，且與病情嚴重程度及預后呈正相關［24］?；诖耍覀冞M一步繪制ROC曲線，分別對CD4+TEM細胞百分率、IL-6和hs-CRP的預測價值進行分析，結果顯示CD4+TEM細胞百分率曲線下面積大于IL-6，提示CD4+TEM細胞具有良好的診斷價值，而CD4+TEM與IL-6和hs-CRP聯合應用則具有更高的預測性，因此急性缺血性卒中發病早期行CD4+TEM細胞檢測，有利于早期干預，改善預后，尤其是與IL-6和hs-CRP聯合應用預測性更強。

本研究結果顯示，與未合并肺感染的急性缺血性卒中患者相比，并發肺感染者外周血CD4+TEM細胞、IL-6和hs-CRP表達水平明顯升高，三項指標聯合應用對急性缺血性卒中肺感染具有良好的預測性，有望成為新型生物學標志物。

利益沖突 無