基于TCGA數據庫肝細胞癌microRNA-324-5p表達與預后危險因素分析

吳城孝， 方 婕， 周霽川， 肖永勝， 張曉光,

（1.復旦大學附屬金山醫院麻醉科，上海 201508；2.復旦大學附屬中山醫院a.麻醉科，b.肝腫瘤外科，上海 200032）

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性腫瘤之一，在我國發病率較高，每年新增病例約36萬例，死亡35萬例[1]。由于癌細胞診斷晚、HCC耐藥、復發和轉移等一系列問題，目前預后仍較差[2-3]。因此，尋找新的生物標志物來預測HCC的進展和預后很有意義[4]。

MicroRNA參與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學過程[5]，在許多癌癥的發生、發展、轉移和復發中起重要作用[6]。MicroRNA(miR)-324-5p參與結腸癌[7]、胰腺癌[8]、膠質瘤[9]等多種惡性腫瘤的生物學過程。目前，miR-324-5p對HCC病人預后影響的研究證據缺乏。本研究擬通過TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫，分析miR-324-5p表達水平與HCC病人總體預后的相關性，探討其作為HCC預后標志物的可行性，為相關的機制研究提供基礎。

資料與方法

一、數據來源

檢索TCGA數據庫(www.cancergenome.nih.gov)下載LIHC項目中的miRNAseq數據，共374例HCC組織和50例正常肝組織。50例正常肝組織包含49例為HCC組織所屬病人的正常肝組織對照，另外1例HCC病人僅有正常肝組織而無HCC組織對照。共375例病人。下載相應臨床資料，于2021年3月下載。某些臨床參數數據缺失的病例在后續該項臨床參數分析時自動剔除。根據miR-324-5p表達水平，分為高表達組與低表達組，用于后續分析。

二、表達差異分析

將RPM格式的miRNAseq數據進行log2轉化后進行樣本間表達的比較。正態性檢驗結果顯示，miR-324-5p表達在兩組內接近正態分布(P＞0.05)。方差齊性檢驗顯示，miR-324-5p表達方差在統計學上不相等(P＜0.05)。故選擇Welch t檢驗分析miR-324-5p在HCC組織和正常肝組織中的表達差異。使用Kruskal-Wallis檢驗和多重假設檢驗(Dunn檢驗)分析miR-324-5p在不同分期HCC組織中的表達。使用R軟件的“ggplot2”軟件包繪制差異散點圖。

三、預后分析

使用R軟件的 “survival”軟件包進行生存分析，使用“survminer”軟件包繪制生存曲線。使用單因素和多因素Cox回歸分析臨床參數與HCC預后的關系，并計算風險比(hazard ratio,HR)。

四、統計學分析

所有數據均用R軟件(3.6.3)處理。計量資料以均數±標準差表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、臨床特征

TCGA數據庫中miR-324-5p高表達組187例，低表達組病人188例。高表達組和低表達組病人的年齡、性別、腫瘤的TNM分期、病理分期、Child-Pugh分級以及肝纖維化Ishak評分[10]、血管侵犯的差異均無統計學意義。高表達組甲胎蛋白＞400 μg1L病人的比例大于低表達組，差異有統計學意義(見表1)。

表1 HCC病人miR-324-5p表達情況與臨床資料特征[n(%)]

二、miR-324-5p表達差異

HCC組織(n=374)中miR-324-5p表達(4.419±0.887)高于正常組織(n=50)(4.055±0.446，P＜0.001)(見圖1A)。不同分期HCC組織中miR-324-5p表達(Ⅰ期 4.439±0.873；Ⅱ期 4.362±0.806；Ⅲ期 4.553±0.959)均高于正常組織(P=0.014，P=0.031，P=0.009)，但不同分期HCC組織間miR-324-5p表達差異無統計學意義(P＞0.05)(見圖1B)。

圖1 miR-324-5p表達差異

三、miR-324-5p表達與HCC病人預后

本研究miR-324-5p高表達組病人總生存(overall survival,OS)期和疾病特異生存(disease specific survival,DSS)期均低于低表達組病人(見圖2)。

圖2 miR-324-5p表達與病人預后生存的關系

單因素Cox分析顯示T分期、病理分期及miR-324-5p表達與HCC病人的OS和DSS相關。進一步多因素Cox回歸分析顯示，miR-324-5p高表達是影響HCC病人OS的獨立危險因素 (HR=1.537,95%CI：1.058～2.233,P=0.024)(見表 2)。

表2 OS的單因素和多因素Cox回歸分析

討 論

本研究探討TCGA數據庫中HCC組織與肝組織中miR-324-5p表達差異，并分析其表達與預后的關系，發現miR-324-5p在HCC組織高表達。HCC病人中，miR-324-5p高表達組預后明顯差于低表達組。單因素和多因素Cox分析結果表明，miR-324-5p高表達可作為HCC病人的獨立預后影響因素。

HCC是常見的肝臟腫瘤，具有惡性程度高、復發率高、預后差等特點，嚴重威脅生命健康。因此，研究肝癌的發生機制、治療和防止復發等策略，均具有重要意義。近年來，許多研究報道了miRNA在發育、細胞增殖、凋亡和腫瘤生物學中的關鍵作用。

miRNA是一組進化保守的非編碼小RNA，通過與靶信使 RNA(MRNA)的 3′-非翻譯區(3′-UTR)互補堿基配對，精確調控基因表達[11]。miRNA在腫瘤的發生或發展過程中起到促進或抑制的作用[12]。Murakami等[13]最早研究了25對HCC和鄰近非腫瘤組織以及9例慢性肝炎的miRNA表達譜。結果表明7個成熟的miRNA和1個前體miRNA(miR-18、miR-224、miR-199a*、miR-199a、miR-195、miR-200a、miR-125a和pre miR-18)在HCC和非腫瘤組織樣本中表達差異明顯。3個miRNA(miR-92、miR-20、miR-18)和1個前體pre-miR-18與HCC的分化程度有關，提示特異性miRNA參與HCC的發展過程，可能成為有價值的生物標志物。此外，許多報道均表明miRNA的異位表達對HCC具有致癌或抑癌作用。這些miRNA可能是HCC治療的靶點[14]。

已有研究證實，miR-324-5p與多種癌癥密切相關[15]。Bamodu等[16]研究發現，miR-324-5p在結腸直腸癌細胞中的高表達對OS的影響呈時間依賴性。高表達組5年和10年的OS率分別為52.50%和43.75%，而低miR-324-5p組5年和10年OS率分別為68.75%和36.50%。Zheng等[17]的研究還證實miR-324-5p在胃癌組織和細胞系中的表達明顯高于對照組，miR-324-5p的過度表達預示著胃癌病人預后不良。對HCC的研究，有報道長鏈非編碼RNA的Linc01134充當miR-324-5p分子海綿并與胰島素樣生長因子2的mRNA(IGF2BP1)結合，形成的Linc011341miR-324-5p1IGF2BP11YY1反饋環路可介導HCC的進展，可能成為HCC的治療靶點[18]。研究發現一種新的DE-lncRNA、RP11-85G21.1(Lnc85)，通過與miR-324-5p的靶向結合和調控，促進HCC細胞的增殖和遷移[19]。

本研究以TCGA數據庫中HCC的miRNA表達譜數據為基礎，樣本量較大，臨床資料完整，為miR-324-5p在預測HCC病人預后方面的研究提供一定的參考。但血清miR-324-5p是否與腫瘤進展水平具有相關性、miR-324-5p能否成為預測HCC病人預后的生物標志物等問題仍需進一步的研究驗證。

綜上所述，miR-324-5p在HCC組織表達上調，與病人不良預后相關，可能是HCC預后判斷的潛在生物學標志物。