石蜘蛛組織培養與建立體外再生體系探究

張 蘭 羅 睿 田 晨 陳海麗

（貴州大學生命科學學院 貴州貴陽 550025）

半夏［P. ternata（Thunb.）Breit.］和石蜘蛛（Pinellia integrifoliaN. E. Brown）都屬于天南星科（Araceae）半夏屬（PinelliaTenore）植物[1-2]。半夏塊莖是一種重要的中藥材（國家藥典委員會2010），而半夏屬的其他植物也常在民間作藥用，如石蜘蛛（又名一面鑼、白鈴子、滴水珠等，是多年生草本植物）具有止痛通竅、解毒散結等功效[3]。半夏的藥用價值、活性成分、地理分布、栽培及繁殖技術等已得到了豐富的研究[4-6]，而對我國特有的石蜘蛛的相關研究還非常欠缺，目前僅有劉玎等（2016）對其lectin基因[7]、劉丹等（2018）對其轉錄組測序及PEBP基因家族成員與珠芽發育關系的分析[8]。石蜘蛛相關研究滯后的一個重要原因在于其自然分布范圍狹窄且無人工栽培種植，這導致研究所需原料來源受限，目前已知其分布區域包括湖北宜昌、四川敘永、重慶和貴州赤水等少數地區[3,9]。在對石蜘蛛進一步研究的同時，為了使其野生資源不被破壞，對其快速繁殖的研究也是必不可少的。本文對其體外再生繁殖體系進行了研究，研究結果可為石蜘蛛的進一步開發利用與野生資源保護奠定基礎。

1 材料與方法

本研究的石蜘蛛采集自貴州省赤水市桫欏國家級自然保護區內[9]，采集的材料種植于實驗室備用。選擇盆栽生長良好的植株，用軟毛刷刷掉塊莖表面土壤及附屬物，將材料放置洗滌液中浸泡10 min，然后用自來水對材料表面沖洗2 h。將表面已清潔的植株分選出塊莖、葉柄和葉片作為外植體備用。對外植體采取最佳消毒方案（75%酒精消毒60 s、無菌水沖洗3 次，0.1%升汞消毒10 min、無菌水沖洗3次）后吸干表面水分并分割成片狀（3 mm×3 mm）或小段（5 mm）備用。

外植體分別接種于添加0.5、1或2 mg/L 6-BA與0.5、1或2 mg/L 2,4-D的MS植物培養基上進行愈傷組織誘導。一個培養瓶接種一個材料，設置環境條件為16 h光照（3 000 lx）/8 h黑暗，溫度24±1 ℃（下同）。培養30 d后觀察并統計愈傷組織誘導率（污染率）及生長情況（愈傷誘導率=外植體長愈傷的個數/（總接種數-污染外植體數）×100%；污染率=污染外植體數/總接種數×100%）。選取生長良好的石蜘蛛愈傷組織分別接種于添加1.5 mg/L或2.5 mg/L 6-BA與0.3 mg/L或0.5 mg/L IBA的MS植物培養基上進行不定芽分化培養，培養30 d后觀察統計石蜘蛛愈傷組織芽分化率（芽分化率=出芽愈傷個數/接種愈傷總個數×100%）及生長情況。選取來自不同部位的外植體的愈傷組織分化形成的不定芽接種到相應用于分化培養的培養基上培養并觀察不定芽的增殖效果，30 d后觀察統計不定芽的增殖率（芽增殖率=芽總數/接種個數×100%）。等芽長到4 cm～5 cm高就轉接到生根培養基上（MS + 0.5 mg/L IBA +0.5 g/L活性炭）或（MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA +0.5 g/L活性炭）培養，培養30 d后觀察材料生根情況。

2 實驗結果

2.1 石蜘蛛不同外植體的愈傷組織誘導

不同激素配比的培養基中石蜘蛛塊莖、葉柄和葉片外植體的愈傷誘導率有明顯差異（表1）。9 種激素配比的培養基均可誘導塊莖和葉柄愈傷組織的發生，而A8和A9兩種激素配比條件下不能誘導葉片愈傷組織的發生。通過觀察及統計學分析，塊莖和葉片的愈傷組織誘導最適培養基為A5（MS + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D），誘導率分別為96.2%和72.0%；葉柄愈傷組織誘導的最適培養基是A3（MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L 2,4-D），誘導率高達96.97%，A5培養基條件下葉柄的愈傷組織誘導率為92.0%，這兩種培養基條件下誘導差異不顯著。

表1 不同激素配比對石蜘蛛不同外植體愈傷組織誘導的影響

外植體（葉片、葉柄、塊莖）接種10 d后，塊莖表面開始出現少量淡黃色疏松顆粒的愈傷組織（圖1A），葉柄隨著愈傷組織的形成逐漸膨大（圖1B），葉片邊緣形成愈傷組織且由于中部組織的生長而凸起導致其脫離培養基表面（圖1C）。30 d之后，葉柄和塊莖完全愈傷化，但葉片大部分枯萎變黃，僅邊緣有少量愈傷組織。

2.2 來源于不同外植體愈傷組織的不定芽誘導分化和增殖

來源于塊莖、葉柄與葉片的愈傷組織都能夠分化形成不定芽（如表2）。相比于低濃度細胞分裂素（6-BA 1.5 mg/L）的添加，高濃度細胞分裂素（6-BA 2.5 mg/L）條件下不定芽分化率更高。在低或高濃度細胞分裂素條件下，生長素（IBA）添加量上調或降低細胞分裂素/生長素比值會降低不定芽分化率（除葉片來源愈傷組織在低濃度細胞分裂素添加時）。在B3（MS + A 2.5 mg/L 6-B +0.3 mg/L IBA）培養基中，細胞分裂素含量及細胞分裂素/生長素比值最大，塊莖、葉柄與葉片來源的愈傷組織的不定芽分化率分別達到最大，分別為92%、92.3%、94.8%。與不定芽分化相對應的激素條件下增殖培養的結果顯示，激素對增殖的影響與對不定芽分化的影響相似。在B3培養基中，塊莖、葉柄與葉片來源的不定芽增殖倍數也分別達到最大，分別為12.8倍、8.9倍、10.7倍，且不定芽的長勢都較好、健壯（圖1D）。

表2 不定芽增殖芽與分化

2.3 石蜘蛛不定芽的生根培養與移栽

在低濃度生長素以及細胞分裂素/生長素比值低的條件下，石蜘蛛不定芽能有效生根（如表3）。在不含細胞分裂素的培養基C2（MS + 0.5 mg/L IBA + 0.5 g/L活性炭）中培養植株生根率達到100%，每株苗具8～15 根，且根長可達10 cm（圖1E）。而在添加少量細胞分裂素的培養基C1（MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA + 0.5 g/L活性炭）中培養植株生根率為87%，具5～8 根，但苗基部產生較多的愈傷組織（圖1F）。選取生根培養20 d后株高在5 cm～10 cm、根系發達的健壯植株，室溫條件下煉苗3 d～5 d后取出組培苗并將根部培養基清除，進行多菌靈處理，之后用清水沖洗（圖1G），然后種植于腐殖土中并置于遮陰環境下，定時灌溉保持環境濕潤。移栽苗在移栽1個月以后都能成活（圖1H）。

表3 不定芽的生根培養

3 討論

雖然植物體細胞很容易表現出全能性，任何植物器官、組織和細胞都可作為外植體用于再生系統建立，但已報道的半夏屬植物組織培養常用塊莖、葉柄和葉片作為外植體。張蘇鋒等（1998）以半夏塊莖、珠芽、葉柄、葉片為外植體誘導愈傷組織，兩周后觀察發現珠芽作為外植體誘導愈傷組織的誘導率最高且生長迅速[4]。羅成科等（2013）以半夏葉片、葉柄、塊莖及根作外植體誘導愈傷組織并進行植株再生培養，培養結果表明葉片作為外植體誘導愈傷組織效果最好[10]。而朱燕燕（2017）及王玉嬌等（2012）在研究滴水珠（Pinell cordataN. E. Brown）快速繁殖體系時發現，葉柄比葉片更適合作為外植體誘導形成愈傷組織[11-12]。本試驗研究結果表明，石蜘蛛葉片、葉柄及塊莖作為外植體進行誘導愈傷組織時，葉片、葉柄兩種外植體的愈傷組織誘導率相差不大（見表1），但是塊莖外植體的愈傷誘導速度更快。綜上所述，不同植物誘導愈傷組織的最適宜外植體不完全一致，導致此結果的可能原因是物種之間的遺傳差異。

培養基中添加的植物激素種類、含量及細胞分裂素/生長素的比值極大地影響組織培養過程中的愈傷組織誘導、不定芽分化與增殖、生根。本實驗運用統計分析得出石蜘蛛塊莖在添加1 mg/L 6-BA和1 mg/L 2,4-D的MS培養基中愈傷誘導率較高（96.2%，見表1），此結果與劉鑫欣等（2011）在半夏愈傷組織誘導上的結果一致[13]。在誘導愈傷組織分化不定芽的培養中，最適半夏不定芽分化的培養基是MS+ 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA[14]，最適滴水珠不定芽分化的培養基是MS + 2.0 mg/L 6-BA +IBA 0.2 mg/L[15]，而本研究發現3 種外植體來源的石蜘蛛愈傷組織分化不定芽的最佳培養基都是MS + 2.5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L IBA，結果與滴水珠更為一致。在生根培養中，朱燕燕等（2017）發現添加微量6-BA（0.1 mg/L）時滴水珠的生根效果最好。而武宗信等（2005）在半夏的生根培養中發現僅添加0.5 mg/L IAA而不添加6-BA時效果最好[16]。本試驗研究結果發現石蜘蛛的生根培養激素條件與半夏一致。半夏屬不同植物在進行愈傷組織誘導、不定芽分化及生根培養所需激素種類、濃度異同的原因有待進一步研究。

本試驗中，石蜘蛛再生體系建立以葉片和塊莖為外植體較佳，愈傷組織誘導最適合培養基為MS + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，不定芽增殖與分化最適培養基為MS+ 2.5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L IBA，生根最適培養基為MS+ 0.5 mg/L IBA + 0.5 g/L活性炭。石蜘蛛再生體系的建立可為研究其藥用價值及野生資源的開發利用奠定基礎。