肺腺癌中核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)體2基因和蛋白表達(dá)及功能的生物信息學(xué)分析

賈春麗，路鵬霏，邱萍，沙婭·馬哈提，楊穎，包永星，張華

原發(fā)性肺癌的發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)居于首位，其中非小細(xì)胞肺癌約占85%，以肺腺癌為主。據(jù)估計(jì)僅在2018年全球新增肺癌患者達(dá)209萬，而肺癌所造成的死亡人數(shù)占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的近20%。盡管新生物標(biāo)志物和治療方法的發(fā)現(xiàn)對肺癌診療做出了巨大貢獻(xiàn)，但由于肺癌的生物學(xué)復(fù)雜性和不良預(yù)后，肺癌患者生存率仍然很低[1-2]。因此尋找新的肺癌治療干預(yù)靶點(diǎn)尤為重要。

核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)體2(riboflavin transporter 2，RFT2)，是一種跨膜蛋白，又名hRFT2、SLC52A3、C20orf54，是核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的重要一員，其作用主要是進(jìn)行核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究證明，核黃素的缺失與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有密切的關(guān)系，人類及其他哺乳動物所需核黃素由飲食獲得或腸道微生物合成[3]，RFT2在核黃素吸收及調(diào)節(jié)核黃素組織分布過程中發(fā)揮的作用尤為重要。其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不十分清楚，本研究擬利用腫瘤公共數(shù)據(jù)庫中該基因的相關(guān)信息，探究該基因在肺腺癌中的表達(dá)以及在發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中的作用，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 RFT2 mRNA 在肺腺癌中的表達(dá)及患者生存狀況分析 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)中輸入RFT2,在樣本數(shù)據(jù)庫中選擇肺腺癌,分析RFT2在肺腺癌組織、癌旁組織及不同臨床分期肺腺癌組織中的表達(dá)水平。進(jìn)一步分析其與肺腺癌患者總生存時間(overall survival，OS) 及無病進(jìn)展生存時間(disease free survival，DFS)的關(guān)系。以RFT2表達(dá)水平的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,對樣本中肺腺癌患者進(jìn)行生存分析。

1.2 RFT2在肺腺癌組織和正常肺組織中蛋白水平的表達(dá) The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org)是基于特制的抗體，并用免疫組化染色技術(shù)展示蛋白在組織中的表達(dá)，可用于正常組織和腫瘤組織蛋白差異表達(dá)分析。本研究中，引用網(wǎng)站中ABAT免疫組化抗體(No.HPA049391)對正常肺組織和肺腺癌的免疫組化實(shí)驗(yàn)，分析RFT2在肺腺癌與正常肺組織中的蛋白表達(dá)差異。

1.3 RFT2蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及功能分析 String數(shù)據(jù)庫(http//string-db.org/)是用于探究蛋白質(zhì)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)的工具，其包含經(jīng)研究證實(shí)和可以預(yù)測的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及生物數(shù)據(jù)庫。本研究中輸入“RFT2”，物種類型選擇“Homo sapiens”，選擇檢索結(jié)果中排名前10的蛋白。利用WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)進(jìn)行功能富集分析，將與RFT2相互作用的關(guān)鍵基因利用WebGestalt分析，了解其參與的細(xì)胞組分、生物過程、生物功能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)計(jì)算肺腺癌組織和正常肺組織中RFT2的表達(dá)差異；利用F檢驗(yàn)分析不同期別肺腺癌RFT2的表達(dá)；采用Kaplan-Meier法計(jì)算RFT2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺腺癌組織和正常肺組織及不同期別肺腺癌組織中RFT2 mRNA表達(dá)比較 GEPIA數(shù)據(jù)庫中收集了483例肺腺癌組織樣本(其中Ⅰ期258例，Ⅱ期117例，Ⅲ期80例，Ⅳ期28例)和347例正常肺組織標(biāo)本，分析發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中RFT2 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常肺組織(P<0.01)，見圖1。進(jìn)一步分析不同期別肺腺癌組織中該基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ⅰ～Ⅳ期肺腺癌組織中該基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.065,P=0.987)，見圖2。

2.2 肺腺癌中RFT2 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 利用GEPIA數(shù)據(jù)中肺腺癌患者的生存數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，以RFT2 mRNA表達(dá)的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，將肺腺癌患者分為RFT2 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組，與低表達(dá)組比較，RFT2 mRNA高表達(dá)患者OS明顯縮短(HR=1.4，P=0.034),而DFS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1，P=0.890，見圖3、4。

圖3 RFT2 mRNA表達(dá)與肺腺癌患者OS的關(guān)系

圖4 RFT2 mRNA表達(dá)與肺腺癌患者DFS的關(guān)系

2.3 肺腺癌組織和正常肺組織RFT2蛋白表達(dá)水平比較 利用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌組織和正常肺組織的免疫組化結(jié)果。RFT2蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃色。在正常肺組織中陽性細(xì)胞較少、染色相對較淺；而在肺腺癌組織中，陽性細(xì)胞明顯增多，RFT2蛋白染色較深，RFT2蛋白呈高表達(dá)，見圖5。

圖5 肺腺癌組織和正常肺組織RFT2蛋白表達(dá)情況

2.4 RFT2的生物信息學(xué)分析 在String數(shù)據(jù)庫中對與RFT2相關(guān)聯(lián)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了10個與RFT2在功能及定位上相關(guān)的蛋白，包括ATP8A2、DLEC1、FLAD1、PLCE1、RAB37、RDH5、RFK、SLC35G2、TMEM173、ATP1B2(圖6)，利用WebGestalt進(jìn)一步對這些蛋白分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要構(gòu)成細(xì)胞膜、內(nèi)膜系統(tǒng)、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。參與生物調(diào)節(jié)、代謝、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等過程，發(fā)揮結(jié)合離子、結(jié)合蛋白質(zhì)、結(jié)合核酸等功能，見圖7。

圖7 RFT2及其相關(guān)聯(lián)蛋白參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能分析

注：DLEC1.肺癌和食管癌缺失基因1；PLCE1.磷脂酶Cε1；FLAD1.黃素腺嘌呤二核苷酸合成酶1；RDH5.視黃醇脫氫酶5；SLC35G2.溶質(zhì)載體家族35成員G2；RFK核.黃素激酶；TMEM173.跨膜蛋白173；ATP1B2.K+-ATP酶β2亞基；RAB37.RAS癌基因家族成員RAB37；ATP8A2.ATP酶氨基磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體Ⅰ類8A型成員2

3 討 論

核黃素(維生素B2)是B族維生素的重要組成部分，它組成人體中重要的黃素輔酶，如黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)的核心部分。在正常的生命活動中，核黃素通過FAD和FMN 2種物質(zhì)形式來間接參與機(jī)體內(nèi)氧化和還原反應(yīng)，是許多氧化還原酶的關(guān)鍵組分，對機(jī)體正常的生命活動必不可少，同時核黃素也通過參與線粒體呼吸鏈運(yùn)轉(zhuǎn)影響ATP的產(chǎn)生[4]。核黃素發(fā)揮上述功能與細(xì)胞的能量代謝、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)緊密相關(guān)，間接影響體內(nèi)各種各樣的生命活動過程[5]。

核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要發(fā)揮生物體跨膜吸收核黃素載體的作用。RFT2基因編碼的蛋白產(chǎn)物有469個氨基酸、11個跨膜結(jié)構(gòu)域[6]。該基因最早由Yamamoto于2009年鑒定出來，后續(xù)研究表明其能特異高效地轉(zhuǎn)運(yùn)核黃素，且在目前已知的核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中效率最高[7]。RFT2作為人核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)核黃素[8-9]。

大規(guī)模食管癌全基因組關(guān)聯(lián)分析證實(shí)，RFT2是食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的易感基因[10]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，RFT2扮演著易感基因與致病基因雙重角色，它能維持核黃素的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和代謝過程，從而使腫瘤細(xì)胞能夠快速增殖的同時減少細(xì)胞凋亡，這一過程在食管癌的發(fā)展中尤為重要。RFT2過表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及對順鉑的耐藥過程，RFT2基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性相關(guān)[11-13]。體外研究證實(shí)，在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)RFT2可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、集落形成，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[14]。

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究方式只能實(shí)現(xiàn)對少數(shù)基因的研究，研究成果有限。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是測序技術(shù)的不斷改進(jìn)升級，基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的大規(guī)模應(yīng)用，研究結(jié)果的產(chǎn)出呈指數(shù)級增長。而公共數(shù)據(jù)庫則整合了多個研究成果，采用目前的生物信息分析技術(shù)對公共數(shù)據(jù)庫中海量信息進(jìn)行整合分析，更有助于從多個維度探究基因與疾病的關(guān)系，進(jìn)一步了解疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的疾病診斷及治療靶點(diǎn)，挖掘疾病的致病機(jī)制。本研究借助公共數(shù)據(jù)庫中TCGA平臺的肺腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)及蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，探究了RFT2在肺腺癌中表達(dá)特點(diǎn)、對預(yù)后影響的及在肺腺癌中發(fā)揮的作用。

本研究結(jié)果顯示，RFT2 mRNA在肺腺癌組織中明顯高于癌旁組織，在RFT2蛋白水平亦觀察到同樣的結(jié)果。人類蛋白質(zhì)圖譜(The Human Protein Atlas)提供人類蛋白在組織和細(xì)胞中的分布，該數(shù)據(jù)庫中免疫組化結(jié)果提示，RFT2蛋白在肺腺癌組織及細(xì)胞中主要位于細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)，利用String數(shù)據(jù)分析提示，其相關(guān)蛋白主要構(gòu)成細(xì)胞膜、內(nèi)膜系統(tǒng)、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與免疫組化結(jié)果一致，在不同期別的肺腺癌組織中該基因的表達(dá)無明顯差異。Fu等[15]發(fā)現(xiàn)，相對于正常大腦組織，RFT2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平顯著上升，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RFT2沉默促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力受到抑制。另外，RFT2對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展也有影響，有研究顯示[16]，相對于正常宮頸組織，RFT2的mRNA和蛋白水平在宮頸癌組織中均明顯上調(diào)，并且RFT2與腫瘤分期明顯相關(guān)。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，RFT2在食管癌組織和食管癌細(xì)胞中均明顯高表達(dá)，上述研究中RFT2蛋白表達(dá)狀況與本研究肺腺癌中該基因的表達(dá)一致。

進(jìn)一步利用GEPIA數(shù)據(jù)分析肺腺癌患者的預(yù)后，RFT2高表達(dá)的肺腺癌患者OS縮短，對患者的DFS無影響，RFT2高表達(dá)提示肺腺癌患者預(yù)后差。在對食管鱗癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中RFT2蛋白高表達(dá)患者預(yù)后差，是食管鱗癌不良預(yù)后的標(biāo)志物[10]。推測可能是高表達(dá)RFT2通過維持核黃素穩(wěn)態(tài)和增強(qiáng)細(xì)胞能量代謝從而支持腫瘤細(xì)胞的快速生長、分裂及避免能量耗竭導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，使腫瘤細(xì)胞能在惡劣營養(yǎng)環(huán)境中存活并使成瘤性增強(qiáng), RFT2蛋白高表達(dá)的腫瘤惡性程度更高，導(dǎo)致患者預(yù)后差。String及WebGestalt數(shù)據(jù)庫對RFT2及相關(guān)蛋白分析顯示，這些蛋白主要位于細(xì)胞膜、內(nèi)膜系統(tǒng)、高爾基體等膜性結(jié)構(gòu)中，參與細(xì)胞生物代謝過程，在結(jié)合蛋白、離子等過程中發(fā)揮著重要作用，但其具體功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，利用腫瘤數(shù)據(jù)庫分析提示RFT2在肺腺癌中呈高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)，參與了細(xì)胞多種生物過程，有可能成為肺癌治療的干預(yù)新靶點(diǎn)，但其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能有待進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

賈春麗：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫；路鵬霏：數(shù)據(jù)獲取；邱萍、楊穎： 參與論文撰寫；沙婭·馬哈提：統(tǒng)計(jì)分析；包永星：研究構(gòu)思，論文終審；張華：課題設(shè)計(jì)；論文修改