PHPS1促進ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性研究

李新新，馬倩，譚鶴，劉美霞，李靜，張雪，路永剛，帖彥清

以動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變為基礎的心肌梗死、腦卒中等疾病是常見病、高發病，致死率和致殘率非常高[1]，因此研究AS具有極高臨床價值。內質網具有折疊、修飾和降解膜結合蛋白的功能，內質網內腔累積的未折疊或錯誤折疊的蛋白質會引發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，從而導致未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)，其與多種人類常見疾病的發生和發展有密切聯系，是近年來研究的熱點[2-4]。研究表明，內質網應激通過不同信號通路在炎性反應、血脂、內皮細胞、巨噬細胞表型轉換和血管鈣化等多個方面參與了AS的發生發展[5-7]。鑒于內質網應激具有同時促進炎性反應和促進凋亡的特征，蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase，SHP-2)對內質網應激和斑塊內細胞凋亡的影響尚不清楚，本實驗采用灌胃方式利用苯肼基吡唑啉酮磺酸鹽1(PHPS1)特異性抑制ApoE-/-小鼠SHP-2，觀察其對內質網應激和動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響，從而探討SHP-2與內質網應激和細胞凋亡的關系，揭示其在動脈粥樣硬化發展中的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物： 6～8周齡ApoE-/-小鼠18只，購自常州卡文斯實驗動物公司，體質量(21±2)g，飼養于SPF級環境中，室溫保持在(22±0.2)℃，給予1.25%膽固醇高脂飼料飼養，不限食水，溫度、濕度、光照均采用自動控制系統。本實驗符合動物倫理委員會要求。(2)試藥試劑：巨噬細胞單克隆抗體CD68(Abcam公司)；平滑肌抗體α-SMA(武漢博士德生物工程有限公司)；TUNEL試劑盒、ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；天狼猩紅染色試劑、Movat染色試劑盒、BCA試劑盒(北京索萊寶試劑有限公司)；磷酸化-PERK、ATF4、CHOP、cleaved-caspase3(Abcam公司)，bcl-2和bax(Proteintech公司)。(3)儀器設備：酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司，型號FC)，全自動凝膠成像系統(英國Syngene公司，型號：Syngene GeneGenius)，石蠟切片機(德國Leica公司，型號：HistoCore BIOCUT)，電泳儀、 轉膜儀(北京六一儀器廠，型號DYY-6C)，正置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司，型號Axio Imager 2)，冷凍高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司，型號：SORVALL Stratos)，熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號：DM3000)。

1.2 實驗方法 2019年1—12月在河北省人民醫院臨床研究中心進行實驗。18只6～8周齡ApoE-/-小鼠按隨機數字表法分成2組：模型組(生理鹽水灌胃)和PHPS1組(PHPS1 0.25 mg·kg-1·d-1灌胃)，各9只，2組同時給予1.25%膽固醇高脂飼料飼養4周。飼養4周后，水合氯醛腹腔麻醉并解剖小鼠，彎鑷摘眼球取血至紅帽促凝管中，靜置30 min后離心取上清于1.5 ml EP管中，-80℃保存用于血脂[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)]和炎性指標[白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)]的檢測；小鼠取仰臥位固定于實驗板上，剖開腹腔和胸腔，將肋骨、胸骨等組織全部剪掉，用一次性輸液器穿刺左心室，輸入生理鹽水，觀察肝臟顏色，完全變白后停止輸注，分離心臟、主動脈弓及其分支至胸腹主動脈。主動脈根部保存于40%多聚甲醛固定后制作石蠟病理切片，降主動脈凍存于液氮中準備提取蛋白。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 小鼠血脂和炎性因子檢測：上述凍存的血清，室溫平衡30 min。血清完全復溶后，充分顛倒，吸取150 μl血清采用全自動生化分析儀檢測血脂指標。依據檢測說明書按步驟采用 ELISA 法檢測IL-1β和TNF-α水平。

1.3.2 動脈粥樣硬化斑塊面積檢測：取出甲醛固定好的主動脈根部組織塊，進行梯度酒精脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋制成石蠟切片并行HE 染色，后經脫水、透明、封片后采用顯微鏡拍照，圖片由圖像分析系統 Image Pro Plus 6.0 測算斑塊面積。

1.3.3 AS斑塊內單核巨噬細胞、平滑肌細胞含量測定：主動脈根部石蠟切片放置于65℃恒溫箱中烘烤120 min，梯度酒精脫蠟、水化后，隨后切片滴加3% H2O2室溫濕盒放置30 min，經蒸餾水沖洗后用pH 6.0檸檬酸緩沖液進行抗原修復，修復后用山羊血清封閉30 min加入巨噬細胞單克隆抗體CD68(1∶1 000)，平滑肌抗體α-SMA抗體(1∶100)4 ℃過夜，第2天冰箱取出，室溫平衡后PBS沖洗多余一抗5 min一次，沖洗3次，之后進行辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶500)室溫濕盒孵育30 min，用PBS沖洗5 min一次，沖洗3次后進行DAB顯色、蘇木素復染、常規脫水、透明后中性樹膠封片，自然晾干，顯微鏡下采集圖像，圖像分析系統 Image Pro Plus 6.0分析動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞、平滑肌細胞的含量。

1.3.4 AS斑塊內膠原含量測定：切片常規進行梯度酒精脫蠟至水, 天狼猩紅—苦味酸飽和溶液染色30 min, 無水乙醇分化脫水, 中性樹膠封片后顯微鏡下采集圖像，圖像分析系統 Image Pro Plus 6.0分析動脈粥樣硬化斑塊內膠原含量。

1.3.5 AS斑塊內細胞凋亡情況測定：主動脈根部石蠟切片常規梯度酒精脫蠟至水，3% H2O2室溫下處理10 min，蒸餾水洗滌，隨后應用新鮮稀釋(1∶200)的Proteinase K 37℃消化15 min，TBS洗滌后加入20 μl標記緩沖液以保持切片濕潤，然后甩掉每張切片上多余液體后加入混合液(TdT和DIG-d-UTP各1 μl，加入18 μl標記緩沖液中，混勻配置成混合液)，混合液加入量為20 μl/片，隨后標本置于濕盒中，37 ℃反應2 h。TBS清洗后滴加封閉液(50 μl/片)，室溫下處理30 min，甩掉封閉液，用自帶的抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后加到標本上，滴加量為50 μl/片。標本置于濕盒中37 ℃反應30 min。TBS充分洗片后加入用抗體稀釋液1∶100稀釋的SABC，濕盒中37℃反應30 min。TBS充分清洗后避光條件下用水溶性封片劑直接封片，400倍熒光顯微鏡下觀察凋亡情況。

1.3.6 AS斑塊內壞死核心面積測定：石蠟切片常規脫蠟至水，取適量預熱的Bouin固定液覆蓋玻片組織處理10 min，流動水沖洗至黃色消失后加入海波溶液處理5 min，沖洗后用阿利新藍染色液處理20 min，預熱堿性乙醇至45～60 ℃，切片沖洗干凈后用堿性乙醇處理10 min，流動水充分沖洗后放入預先配置好的Weigert蘇木素染色液中，繼續避光染色60 min，再次沖洗干凈后入藏紅花品紅染色液，避光染色1 min，磷鎢酸處理5 min，直接轉入弱酸分化液中5 min，常規脫水、透明中性樹膠封片后顯微鏡下采集圖像，應用圖像分析系統 Image Pro Plus 6.0分析斑塊內壞死核心面積，并進行比較。

1.3.7 AS斑塊內內質網應激及凋亡蛋白(p-PERK、ATF4、CHOP、cleaved-caspase3、bax和 bcl-2)表達檢測：將凍存的降主動脈組織取出解凍，充分研磨制成勻漿后冰上裂解 30 min，4℃離心15 min獲取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。準備電泳緩沖液、分離膠、濃縮膠及玻璃板、電泳槽等相關試劑及物品，將配好的分離膠加入玻璃板內，用去離子水覆蓋，約40 min后倒掉玻璃板上面的水，并用濾紙吸干凈剩余去離子水后加入已配好的堆積膠隨后插入梳子，大約20 min后濃縮膠凝固，仔細觀察是否存在漏液，不漏液情況下拔掉梳子并沖洗上樣孔上樣(30 μg體系)，同時電泳槽中加入電泳緩沖液，恒壓80 V 40 min，110V 1 h左右，電泳完成，隨后進行轉膜，再進行5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗：磷酸化-PERK(1∶1 000稀釋), ATF4(1∶1 000稀釋)、CHOP(1∶500稀釋)，cleaved-caspase3(1∶1 000稀釋)、bcl-2(1∶1 000稀釋)和bax(1∶1 000稀釋)4℃過夜，第2天TBST洗5次，每次5 min，洗凈未結合的一抗，加入對應二抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育2 h，之后上機進行曝光并保存圖片。UVP 凝膠成像分析系統采圖，IPP 6.0軟件行灰度掃描分析, 以GAPDH為內參校正目的蛋白表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析。符合正態分布計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組小鼠血清血脂、炎性因子水平比較 與模型組比較，PHPS1組小鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C差異無統計學意義(P>0.05)，但血清IL-1β和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 2組ApoE-/-小鼠血清血脂及炎性因子水平比較

2.2 2組小鼠AS斑塊面積比較 與模型組小鼠比較，PHPS1組小鼠斑塊面積明確增大(28 768.107±6 478.090 vs. 17 754.921±2 021.590)μm2，差異具有統計學意義(t=4.869，P=0.001)，見圖1。

圖1 2組ApoE基因敲除小鼠斑塊面積比較

2.3 2組小鼠AS斑塊內單核巨噬細胞、平滑肌細胞和膠原含量比較 與模型組小鼠比較，PHPS1組小鼠斑塊內平滑肌和膠原含量差異無統計學意義(P>0.05)，斑塊內巨噬細胞含量增加 (P<0.01)，見表2、圖2。

注： 石蠟切片染色圖中箭頭所指為各個指標所統計的陽性代表區域；A.免疫組化染色，×40；B.免疫組化染色，×40；C.天狼猩紅染色，×40

2.4 2組小鼠AS斑塊內細胞凋亡和壞死核心面積比較 PHPS1組細胞凋亡陽性面積及斑塊內壞死核心面積[(452.484±93.900)μm2及(654.034±46.940) μm2]均高于模型組[(190.106±42.533)μm2及(281.545±44.855)μm2]，差異有統計學意義(t=7.636、17.212，P=0.000、0.000)，見圖3。

注：A.免疫熒光染色，×400；B.Movat染色，×40

2.5 2組小鼠AS斑塊內磷酸化-PERK(p-PERK)、 ATF4、CHOP和cleaved-caspase3、 bax、bcl-2蛋白表達水平比較 與模型組小鼠比較，PHPS1組小鼠p-PERK、 ATF4、CHOP、cleaved-caspase3、bax蛋白表達水平均升高，bcl-2蛋白降低(P<0.01)，見圖4。提示PHPS1促進內質網活化；內質網活化后可以促進以cleaved-caspase3、bcl2、bax為代表的凋亡途徑。

3 討 論

動脈粥樣硬化是在世界范圍內發病率極高的一種疾病，發病機制復雜，主要是由血脂紊亂和炎性反應雙重因素導致，目前的機制普遍認為AS是一種炎性反應性疾病。動脈粥樣硬化斑塊中不同細胞在其發生發展中起到不同作用：巨噬細胞是斑塊內最主要的細胞成分，分泌多種炎性反應因子吞噬脂質形成早期斑塊，在過度內質網應激、線粒體損傷等多種有害作用下會導致死亡，形成壞死核心并釋放內源性炎性反應源，加劇AS進展和斑塊的不穩定性[8-9]；平滑肌細胞通過遷移、增殖和表型轉換參與AS進程，釋放和合成膠原形成纖維帽對斑塊進行保護[10]；膠原可以對抗血流沖擊、維持AS結構，并對斑塊穩定性起到重要作用[11]。

酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHIP1、SHP-2和酪氨酸激酶SYK、Src等是維持機體平衡的重要因子，互為平衡，相互促進和制約[12-14]。既往研究表明，SHP-2可通過直接或間接途徑激活SYK、Src等激酶，但又具有抑制炎性反應水平的作用，參與了生殖、分化、發育凋亡等眾多領域,具有功能多樣性、機制不確定性，在不同疾病中，不同階段可能具有不同的作用[15-17]。敲除SHP-2后小鼠胚胎不能成熟，易導致死亡，所以目前以應用其特異性抑制劑PHPS1為理想干預手段[18]。本實驗從血脂水平、炎性因子水平、動脈粥樣硬化斑塊內容物含量變化方面發現，用PHPS1抑制SHP-2后小鼠體內以IL-1β和TNF-α為代表的炎性因子水平升高，提示體內炎性反應擴大，斑塊面積增加，巨噬細胞的含量增加，提示動脈粥樣硬化進展惡化。本課題組前期研究發現，抑制SHP-2表達后，巨噬細胞的吞噬功能增強[19]，說明SHP-2在早期可以通過影響炎性反應、巨噬細胞功能和數量，起到抑制AS發生發展的作用。

注：A.內質網應激蛋白表達；B.凋亡蛋白表達。與模型組比較，aP<0.01

斑塊內部的高炎性反應和高氧化應激狀態極易誘發凋亡，細胞過度凋亡，壞死核心擴大，造成斑塊的不穩定性增加[20]，通過細胞凋亡免疫熒光和斑塊Movat染色發現，應用PHPS1后斑塊內細胞凋亡增加，壞死核心面積增大，說明斑塊內部穩定性下降，提示動脈粥樣硬化加重，易引發嚴重臨床并發癥。ERS具有促進炎性反應和凋亡的作用[21-22],目前研究得知的機制涉及到內質網膜上的3種跨膜蛋白激酶：蛋白質激酶 RNA 樣 ER 激酶(proteinkinase RNA-like ER kinase，PERK)、肌醇需求蛋白1(inositol-requiring protein 1，IRE1)和激活轉錄因子 6(activating transcription factor-6，ATF6)[23], PERK磷酸化后被活化，可通過促進ATF4和CHOP表達進而促進凋亡，是目前已知的強有力的促凋亡通路。

既往研究證實，UPR及ERS持續激活會導致CHOP表達增加，最終激活其誘導的細胞凋亡信號通路[24]，本實驗通過細胞凋亡檢測和Western-blot檢測內質網應激線粒體凋亡通路，證實SHP-2可以抑制過度的內質網應激，改善細胞凋亡，穩定斑塊，從而抑制AS的進展。動脈粥樣硬化病變中存在大量巨噬細胞,尤其是CHOP高表達巨噬細胞，CHOP主要通過促進內質網儲存的鈣離子持續釋放促進細胞凋亡,其機制包括通過CHOP轉錄目標內質網氧化酶(ERO)的激活使得IP3R調節的鈣離子釋放，進而誘發并促進線粒體產生ROS和激活凋亡通路中cleaved-caspase3、bcl-2、bax進而促進凋亡形成[25]。

綜上所述，SHP-2可以從炎性分子水平、巨噬細胞含量、內質網應激與凋亡等多個方面抑制AS的發生發展，有望成為動脈粥樣硬化疾病的有效調控靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李新新、馬倩：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；譚鶴、張雪：分析試驗數據，進行統計學分析；劉美霞、李靜：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；路永剛：課題設計，論文修改；帖彥清：提出研究思路，論文審核