miR-103、OLFM4 mRNA在前列腺癌組織中的表達及其臨床意義

鮑文瀾，朱傳營，張林，劉海龍，鄭磊貞

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是最常見的男性惡性腫瘤之一，約占男性惡性腫瘤的19%，也是癌癥相關死亡常見的原因之一，發病率極高，常伴有遠處轉移[1-2]。骨骼是其最常見的轉移部位，可引發骨痛、骨折和神經壓迫，極大降低患者的生活質量[3]。因此需要了解PCa的詳細作用機制，以期找到有效療法[4]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼單鏈小RNA，可在轉錄水平調節細胞的生長、凋亡和遷移[5]。大量研究已證實癌細胞的正常調節機制可被miRNA的異常表達干擾，并且已有多種miRNA被作為PCa診斷、治療和預后的生物標志物[6]。而最近有研究發現，miR-103可通過調控程序性細胞死亡因子10(PDCD10)在PCa發生機制中起重要作用[7]。嗅覺介導素4(OLFM4)通常在特定組織中表達，可調節細胞生長和凋亡等重要的細胞過程，并且OLFM4在不同腫瘤階段和癌組織的發生發展中具有獨特的調節作用，如在胰腺癌中其表達上調，而在PCa中則表達下調[8-9]。但目前還未發現關于miR-103和OLFM4在PCa臨床中的研究，現檢測miR-103、OLFM4信使核糖核酸(mRNA)在PCa組織中的表達及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月—2015年9月上海交通大學醫學院附屬新華醫院腫瘤科和泌尿外科手術切除PCa患者120例為PCa組，年齡52～81(66.34±8.26)歲，其中<65歲53例，≥65歲67例；血清前列腺特異性抗原(PSA)≤10 ng/ml 59例，>10 ng/ml 61例；臨床分期[10]：T2期51例，T3期40例，T4期29例；病灶轉移36例，未轉移84例；Gleason評分[10]：≤7分72例，>7分48例。選取良性前列腺增生患者50例為對照組，年齡54～79(65.92±7.39)歲。本研究經醫院倫理委員會批準,患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 PCa病例選擇標準 (1)納入標準：①患者術前經造影等手段檢查；②術后經病理確診，臨床資料完整；③全部患者均進行手術切除治療，術前未進行其他輔助性治療。(2)排除標準：①合并其他免疫系統疾病；②術前經內分泌及化療治療。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 前列腺組織miR-103、OLFM4 mRNA表達檢測：手術中取PCa組織和良性前列腺增生組織，生理鹽水清理干凈后，置-80 ℃冰箱備用。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-103、OLFM4 mRNA水平。將上述樣本組織勻漿化，使用RNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司生產)提取PCa組織和良性前列腺增生組織總RNA，根據反轉錄試劑盒(日本Takara公司生產)說明書反轉錄成cDNA(反轉錄反應體系：總RNA 2 μl、RNase Free dH2O 20 μl、PrimeScript RT Master Mix 4 μl )。以cDNA為模板，根據熒光定量PCR試劑盒說明書(北京天根生化有限公司生產)使用熒光定量PCR儀(上海羅氏診斷產品有限公司，型號 LightCycler?96)檢測樣本中miR-103、OLFM4 mRNA的表達水平(反應體系：cDNA模板0.5 μl、ddH2O 5 μl、正向引物0.5 μl、反向引物0.5 μl、2×Taq PCR master mix 6.5 μl)。用U6作為miR-103的內參，β-actin作為OLFM4的內參對mRNA標準化，通過2-△△Ct分析miR-103、OLFM4 mRNA的表達水平。引物由北京安必奇生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.2 隨訪情況：對術后出院的PCa患者進行為期5年的隨訪，每月隨訪1次，截止時間為死亡時間或至2020年9月30日，以電話或復查形式記錄患者術后生存情況，未出現失訪病例。

2 結 果

2.1 2組miR-103、OLFM4 mRNA表達水平比較 PCa組癌組織中miR-103和OLFM4 mRNA表達水平顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 2組前列腺癌患者miR-103、OLFM4 mRNA表達水平比較

2.2 miR-103、OLFM4 mRNA在不同PCa臨床病理特征的表達比較 分別以PCa組織中miR-103、OLFM4 mRNA表達水平中位數0.31和0.43為標準分為高、低表達組，大于中位數為高表達，等于或小于中位數為低表達。PCa組織中miR-103、OLFM4 mRNA表達水平在不同年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)；在不同PSA水平、臨床分期、有無病灶轉移、Gleason評分比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 miR-103、OLFM4 mRNA在不同PCa臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 PCa組織中miR-103、OLFM4 mRNA表達水平與生存預后的關系 經過5年隨訪，120例PCa患者生存96例(80.00%)，死亡24例(20.00%)。miR-103 mRNA高表達組生存率為93.33%(56/60)，高于miR-103 mRNA低表達組的66.67%(40/60)(χ2=13.744，P=0.000)。OLFM4 mRNA低表達組生存率為68.33%(41/60)，低于OLFM4 mRNA高表達組的91.67%(55/60)(χ2=10.382，P=0.001)，見圖1、2。

圖1 miR-103 mRNA表達水平與PCa患者預后生存的關系

圖2 OLFM4 mRNA表達水平與PCa患者預后生存的關系

2.4 影響PCa預后因素的Logistic回歸分析 多因素Logistic分析發現，PSA高水平、臨床高分期、病灶轉移、Gleason高評分、miR-103 mRNA低表達和OLFM4 mRNA低表達均是影響PCa患者預后生存的獨立危險因素(P<0.01)，見表4。

表4 PCa患者預后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

PCa是影響全球男性生命健康的惡性腫瘤疾病，其患者多為中老年人[11]。隨著人口老齡化速度加快，生活、飲食習慣的改變，我國PCa發病率逐年增長。PCa的治療在過去幾年內取得了很大進步，約80%的病例確診為局部PCa，其總生存率較高，而晚期和轉移病例生存率與之相比則顯著降低[12-14]。目前PCa治療的最大挑戰是無法精確診斷疾病嚴重程度，以進行相應的治療[15-17]。因此尋求可靠的生物標志物有助于PCa患者的診斷及治療，還可在臨床中起重要決策作用。

miRNA是一種非編碼的單鏈小分子RNA，可在轉錄后水平調節基因表達，大量研究已證實癌細胞的正常調節機制可被miRNA的異常表達所干擾，并且已有多種miRNA已被作為PCa預后、診斷和治療的生物標志物，如微小RNA-127-3p(miR-127-3p)和miR-143可作為腫瘤抑制劑靶向PCa中的多種癌基因，這些發現為PCa的治療提供了新的方法[18-21]。miR-103可參與生物學功能的各種調控過程，并且在多種癌癥發生發展中起到重要調控作用[22]。miR-103在不同類型腫瘤組織具有不同的調控作用，如miR-103在結腸癌患者血清中表達顯著高于對照組，而在PCa細胞系中顯著下調[7，23]。還有研究表明，miR-103a-3p可通過下調腫瘤蛋白D52(TPD52)的表達起到抗PCa作用，抑制癌細胞的生長[24]。本研究發現，miR-103在PCa組癌組織中的表達水平顯著低于對照組，這表明miR-103可能與PCa的發病機制有關，其可能通過調節靶基因來參與PCa的發生。本研究還發現，PCa患者癌組織中miR-103表達水平與PSA水平、臨床分期、有無病灶轉移和Gleason評分明顯相關，提示miR-103可能參與PCa的發展進程，并且與臨床病理特征密切相關。

OLFM4為腫瘤抑制基因，可編碼與嗅覺介質相關的蛋白，在細胞間黏附、細胞周期調控和腫瘤發生過程中起重要調節作用[25]。OLFM4在不同腫瘤組織中具有不同的表達模式。OLFM4在宮頸癌中上調，但在PCa中其表達受到阻礙，還可通過調控乳腺癌中基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達抑制乳腺癌腫瘤細胞的遷移和侵襲[26]。近幾年有研究表明，OLFM4在PCa中具有抗腫瘤作用，其在前列腺增生組織中表達較高，但在PCa癌組織中則表達降低，其表達降低與前列腺癌中OLFM4啟動子的CpG位點(-681、-446和-91)甲基化狀態有關[9]。本研究中，OLFM4 mRNA在PCa癌組織中的表達水平顯著低于對照組，與上述研究結果相一致。這表明OLFM4 mRNA在PCa組織中的表達受到抑制，可能與OLFM4啟動子的CpG位點甲基化程度增加有關。本研究還發現，PCa患者癌組織中OLFM4 mRNA表達水平與PSA水平、臨床分期、有無病灶轉移和Gleason評分有關，這表明OLFM4 mRNA可能在PCa的發展進程中發揮作用。

本研究通過分析PCa患者術后5年生存率發現，miR-103和OLFM4 mRNA高表達患者5年生存率分別比對應的低表達患者高。這表明miR-103和OLFM4 mRNA低表達可能會降低PCa患者的術后生存率。除此之外，多因素Logistic分析發現，PSA高水平、臨床高分期、病灶轉移、Gleason高評分、miR-103 mRNA低表達和OLFM4 mRNA低表達均是影響預后生存的獨立危險因素。這表明miR-103和OLFM4 mRNA可作為臨床治療和預后監測指標用以跟蹤病情發展狀況。

綜上所述，miR-103和OLFM4 mRNA在PCa癌組織中均呈低表達，且與PCa患者臨床病理特征及預后相關。miR-103和OLFM4 mRNA有作為PCa患者預后不良生物標志物的潛能，可為PCa的臨床治療提供新的方向，但兩者在PCa中的詳細作用機制還需進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

鮑文瀾：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；朱傳營：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；張林：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；劉海龍：進行統計學分析；鄭磊貞：課題設計，論文撰寫