植冰技術(shù)在低溫生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

李維杰,宋立勇,劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

0 引言

細(xì)胞低溫保存是廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)、器官移植和輔助生殖的一項關(guān)鍵技術(shù)。根據(jù)兩因素假說，細(xì)胞在冷凍過程中會發(fā)生溶質(zhì)損傷[1-2]和胞內(nèi)冰損傷[3]。慢速冷凍過程中，細(xì)胞受到較高濃度的溶質(zhì)損傷，快速冷凍過程中，細(xì)胞脫水不充分，受到胞內(nèi)冰損傷。在細(xì)胞低溫保存領(lǐng)域，確定一個最佳的降溫速率非常關(guān)鍵，既能降低溶質(zhì)損傷，又能避免胞內(nèi)冰損傷。冰核的開始是一個隨機事件，它與溶液的過冷度密切相關(guān)[4-6]，溶液的過冷度取決于溶液的性質(zhì)和工藝條件，過冷度很重要，它決定了冰核的數(shù)量，從而決定了細(xì)胞溶液中冰晶的數(shù)量和大小。根據(jù)熱力學(xué)原理，當(dāng)溶液過冷至熔點溫度以下時，才會出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象。冰晶的生長過程是水分子在晶核表面形成氫鍵并有序排列的過程，水分子結(jié)晶包括兩個過程，晶核的形成和冰晶的生長。晶核存在一個臨界尺寸，晶核大于臨界尺寸時冰晶才能進(jìn)一步生長，晶核小于臨界尺寸時則融化[7]。晶核臨界尺寸和細(xì)胞溶液的過冷度有關(guān)，過冷度越高，晶核臨界尺寸越小，溶液內(nèi)部會形成更多穩(wěn)定的晶核[8]。在低溫保存細(xì)胞的過程中，存在一個最佳的降溫速率，既能讓細(xì)胞充分脫水，避免胞內(nèi)冰損傷，又能避免過高的保護(hù)劑濃度的毒害。但在實際降溫過程中，過冷度的存在會使得細(xì)胞溶液因釋放潛熱，溫度上升，導(dǎo)致細(xì)胞的降溫速率遠(yuǎn)高于最佳的降溫速率，在較高的過冷度以及較高的降溫速率下，會引起細(xì)胞不可控的結(jié)晶，細(xì)胞突然結(jié)冰，細(xì)胞脫水不充分，胞內(nèi)冰大量生長，細(xì)胞大量死亡。本文綜述了多種不同的誘導(dǎo)成核方法來降低過冷度，減小胞內(nèi)冰的損害。

1 通過接觸外壁形成局部過冷誘發(fā)成核

目前的理論認(rèn)為，為了避免胞內(nèi)冰損傷，我們通常不會采取快速冷凍的方法，細(xì)胞在快速冷凍的情況下，細(xì)胞內(nèi)水來不及向外滲透就會結(jié)冰[2,9]。在慢速冷凍情況下，細(xì)胞有足夠的時間脫去細(xì)胞內(nèi)水分，但是這種情況通常會導(dǎo)致細(xì)胞長時間暴露于高濃度電解質(zhì)的保護(hù)劑溶液中，也會導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡[1]，確定細(xì)胞的冷凍保存方案至關(guān)重要。胞內(nèi)冰的形成還與水的過冷度有關(guān)，過冷度越大，細(xì)胞受到胞內(nèi)冰的損傷越大。

接觸外壁誘發(fā)成核的方案通常是將凍存管冷卻到較高的零下溫度，通過使用預(yù)冷探針，金屬棒或手術(shù)鉗來接觸容器的側(cè)面，從而提供局部過冷來誘發(fā)成核[10-11]，如圖1所示。MAZUR[12]指出酵母細(xì)胞在-2.5 ℃時植冰的存活率高于在-16 ℃時自發(fā)凍結(jié)的存活率，此后，大量研究已經(jīng)使用該方法來保存細(xì)胞[13-16]。較高溫度下，植冰過程可以抑制胞內(nèi)冰的形成，但是這種通過液氮預(yù)冷的手術(shù)鉗去接觸外壁的方式通常成功率不是很高，有時候需要多次接觸才能實現(xiàn)，甚至可能失敗。為了增加植冰的成功率，可以在凍存管或容器的底部增加一個金屬貼片，然后再用預(yù)冷后的手術(shù)鉗去接觸該金屬貼片，利用金屬貼片的快速導(dǎo)熱在溶液內(nèi)部形成局部過冷點來誘發(fā)成核[17]。

圖1 接觸外壁形成局部過冷誘發(fā)成核[15]

當(dāng)然,在低溫顯微鏡下也可以完成接觸外壁植冰的過程，為了在低溫顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，通常會采取預(yù)冷探針或注射器針頭接觸載玻片上樣品的方式完成植冰過程。YANG等[18]發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰總是優(yōu)先在靠近細(xì)胞核的細(xì)胞膜產(chǎn)生，隨著溫度降低，胞內(nèi)冰會從靠近細(xì)胞核的細(xì)胞膜上穿過細(xì)胞核，再逐漸傳遞到細(xì)胞質(zhì)。沒有經(jīng)過植冰處理的細(xì)胞會產(chǎn)生細(xì)小的冰晶，經(jīng)過植冰處理的細(xì)胞會產(chǎn)生較大的冰晶，并且不植冰產(chǎn)生的細(xì)小冰晶比植冰產(chǎn)生的大冰晶相比，更容易催化胞內(nèi)冰的形成，這很可能是細(xì)小的冰晶更容易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)啟動胞內(nèi)冰的形成，這符合孔理論機理。這種細(xì)小的冰晶更容易穿透細(xì)胞膜，還可能跟細(xì)胞脫水的水運輸有關(guān)[19]。雖然植冰技術(shù)對胞內(nèi)冰影響的理論有很多猜想，但至今未能達(dá)到統(tǒng)一。通過接觸外壁植冰的方式在細(xì)胞低溫保存領(lǐng)域[13]和胚胎低溫保存領(lǐng)域[20]有很大的應(yīng)用。

2 通過添加冰成核劑誘發(fā)成核

通常溶液在低于熔點的溫度下仍能保持液態(tài)，這種被稱為過冷現(xiàn)象，液態(tài)水向冰轉(zhuǎn)變的過程為成核和結(jié)晶的過程，這種促進(jìn)其轉(zhuǎn)變的物質(zhì)稱為冰成核劑。生物系統(tǒng)中存在很多冰成核劑，其中最普遍的為假單胞菌屬、黃單胞菌屬、歐文氏菌屬。1974年MAKI等[21]首次在腐爛的樹葉中發(fā)現(xiàn)了這種冰核細(xì)菌，這種冰核細(xì)菌可催化-1 ℃的過冷水凍結(jié)[22]。自冰核細(xì)菌可以作為冰成核劑以來，逐漸發(fā)現(xiàn)這種冰核細(xì)菌的主要影響因子是SNOMAX?，SNOMAX?是一種商品化的成核劑，SNOMAX?可以作為控制溶液結(jié)晶溫度很好的工具，SNOMAX?的植冰作用不受低溫保護(hù)劑或培養(yǎng)基中多種物質(zhì)的影響，并且很少比例的SNOMAX?就可以降低溶液過冷度[23-24]。冰成核劑可以完全替代手動貼壁植冰，成功保存了蟾蜍卵母細(xì)胞和小鼠胚胎等[25-26]。

有機物中冰成核劑最常見的是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)冰成核劑在較高的零下溫度可以觸發(fā)凍結(jié)[27]。DU等[28]發(fā)現(xiàn)生物體中溶菌酶在較高過冷度下也有促進(jìn)冰成核的作用，溶菌酶可以降低成核相與外來粒子之間的界面自由能，它可以改變冰核形成過程中的界面動力學(xué)。

碘化銀作為冰成核劑時，在低溫保存中的應(yīng)用也相對廣泛。KOJIMA等[29]利用1%碘化銀以連續(xù)抽吸的方式來誘導(dǎo)冰晶形成，或者利用海藻酸鈉和氯化鈣反應(yīng)生成的海藻酸鈣凝膠固定碘化銀，將固定的碘化銀浸入冷凍溶液中引發(fā)冰核，該方法成功保存了兔和牛胚胎[30]。其他類物質(zhì)，如生物醇類物質(zhì)也有發(fā)現(xiàn)冰成核劑的存在。MASSIE等[31]首次將類固醇類冰成核劑應(yīng)用在肝細(xì)胞冷凍保存中，成功將肝細(xì)胞存活率提高至85%。醇類物質(zhì)能被作為冰成核劑與碘化銀成核機制相似[32]，理論認(rèn)為醇類和碘化銀能通過與冰的結(jié)構(gòu)配合形成高效的冰核團(tuán)，有效冰晶之間的晶格或結(jié)構(gòu)匹配，形成有序的結(jié)晶簇。根據(jù)朗繆爾單分子層在誘導(dǎo)冰成核中的應(yīng)用[33]，兩親體的壓縮或未壓縮單分子層均可促進(jìn)單分子溶液界面的晶體定向生長。這種誘導(dǎo)是通過有核晶體的附著面與親水頭之間的結(jié)構(gòu)配合或互補實現(xiàn)。

一般情況下，均相成核只存在于純凈水中，在低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，一般具備異相成核的條件[34]。冰成核劑在較高的零下溫度提前誘發(fā)了異相成核，但是使用冰成核劑有一個缺點，即使可以在較高的溫度下誘發(fā)成核，也無法控制在特定溫度下成核，這不利于研究植冰溫度對細(xì)胞存活率的影響。

3 通過電極頭誘發(fā)成核

直接電凍結(jié)的方法是一種外部冷凍方法，它是將溶液冷卻到所需的較高的零下溫度，打開電源，在電極兩端施加一定的電流脈沖，促進(jìn)浸在電極里的溶液成核，并進(jìn)一步結(jié)晶。1951年RAU[35]首次報道了施加在金屬電極上的高壓可以在過冷水中引起成核。此后的研究主要集中在電流強度、電極頭材料的選擇以及電極端口的設(shè)置[36-37]。對于直接電凍結(jié)裝置雖然能允許許多樣品的冰核化過程。但是，無論是細(xì)胞還是生物組織的低溫保存，通常會在溶液中加入適量濃度的低溫保護(hù)劑，而低溫保護(hù)劑的添加會抑制電極成核,并且大量賦形劑像鹽類物質(zhì)，它的存在會抑制冰核。為了避免這種抑制作用，間接電凍結(jié)裝置代替了直接電凍結(jié)裝置，該裝置通過高壓電脈沖引發(fā)單獨體積的純水中誘導(dǎo)成核，生長的冰晶在通過狹窄的管子導(dǎo)入樣品引發(fā)樣品成核，該裝置能實現(xiàn)獨立于樣品成分的冰核生成。PETERSEN等[7]首次將電極凍結(jié)應(yīng)用在低溫生物學(xué)中，該裝置易于處理，成核效果好。與直接電凍結(jié)裝置相比，這種設(shè)計使通過電極成核的冰晶獨立于要保存的溶液，避免了溶液中添加劑對電極成核的影響，成核溫度要比直接電凍結(jié)更高，但是只允許相同條件下冷凍8個樣品。SPINDLER等[38]利用該電凍結(jié)裝置成功誘導(dǎo)了人肺內(nèi)皮細(xì)胞成核，得出在較高的成核溫度下，可以大大降低低溫保護(hù)劑的濃度，減小細(xì)胞低溫保存中的損傷。

4 通過搖晃、振動和超聲波等形式誘發(fā)成核

過冷液體中搖晃、振動以及超聲波等形式都會誘發(fā)成核。針對超聲波空化現(xiàn)象引起的空化冷凍成核的研究有3種理論模型：1）HICKLING[39]認(rèn)為在空化氣泡破裂的最后階段會發(fā)生大于1 GPa的壓力，由于氣泡附近冰團(tuán)的聚集，從而增加水的平衡凍結(jié)溫度并導(dǎo)致冰成核；2）HUNT等[40]認(rèn)為空化氣泡破裂的負(fù)壓會增加水的平衡凍結(jié)溫度并導(dǎo)致成核；3）CHOW等[41]認(rèn)為當(dāng)空化氣泡產(chǎn)生劇烈的循環(huán)運動，氣體進(jìn)出氣泡以及周圍的流體中形成強渦流時都會形成微流，微流可以增強伴隨冷凍過程的傳熱和傳質(zhì)過程，溶液達(dá)到一定過冷度，可能會觸發(fā)成核。上述3種理論模型中，空化氣泡在冰的成核中起著重要的作用。

目前已經(jīng)將超聲波成核應(yīng)用于新鮮食品的冷凍保存，冰淇淋制造，珍貴食品、維生素和營養(yǎng)物的保存，藥物、疫苗的冷凍濃縮和冷凍干燥過程等。在低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，超聲波植冰技術(shù)也有潛在的應(yīng)用，超聲波植冰技術(shù)可以被確定用來藥物凍干，減少蛋白質(zhì)凍干過程中的時間，并且可獲得較高的酶活性[42-44]。關(guān)于超聲波植冰技術(shù)機理的研究眾說紛紜，其中就第一種理論模型的證明居多。SACLIER等[45]通過引入額外的動力學(xué)表達(dá)式來表達(dá)由于超聲輻射引起的成核機理，提出了利用超聲模擬冷卻結(jié)晶過程的模型，該機制認(rèn)為，空化氣泡分裂的最后階段出現(xiàn)的極高壓力會增加水的平衡凍結(jié)溫度，從而增加過冷度，而過冷度是冰核化的驅(qū)動力[46]，這與第1種理論模型一致[47]。ZHANG等[48]認(rèn)為不能僅通過常規(guī)模型來解釋傳統(tǒng)模型中空化氣泡的破裂觸發(fā)了冰的成核作用，液體中大小不同氣泡分布的水不能代替空化氣泡。空化氣泡引起的多次成核事件已經(jīng)被研究的很多，但是對單個成核的詳細(xì)觀察少有研究，OHSAKA等[49]發(fā)現(xiàn)了一種技術(shù)，可以產(chǎn)生1個單一氣泡，并且可以維持較長的時間。他觀察到在過冷水中空化氣泡可以引起冰成核。該研究也證明了成核是由于氣泡破裂相關(guān)的高壓脈沖引起的凝固點移動造成的。

在超聲波作用下，冰的成核始終會發(fā)生在較高的零下溫度，成核溫度對冰晶生長狀態(tài)有很大的影響，較低的成核溫度可獲得大量的小冰晶，較高的成核溫度可獲得大而定向的冰晶，這在細(xì)胞低溫保存領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。

5 通過改變降溫速率誘發(fā)成核

該方法也可以稱為改變降溫速率驟冷的方法，先以較慢速度進(jìn)行降溫，突然以較快的降溫速率降溫，造成局部溫度差異，形成局部過冷，促進(jìn)成核。在低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有一定的應(yīng)用，該方法適用于細(xì)胞的冷凍保存。與新鮮細(xì)胞相比，DIENER等[50]利用此方法保存了大鼠肝細(xì)胞，并獲得較高的成活率，酶活性無顯著差異。這種突然降低降溫速率的方法實則是給溶液一個較大的冷卻沖擊，在溫度稍微高的溶液中產(chǎn)生一個局部過冷誘導(dǎo)成核，生物反應(yīng)器冷沖擊也是利用了這個原理，能夠保存大量哺乳動物細(xì)胞系和組織等[51-52]。

6 通過惰性氣體改變壓力或者結(jié)合冰霧技術(shù)誘發(fā)成核

通過惰性氣體先加壓再迅速減壓，從而在小瓶的液體表面形成冰核，這在低溫凍干領(lǐng)域有一定的應(yīng)用[53-54]，冰成核的主要驅(qū)動力被認(rèn)為是由于突然減壓引起的振動擾動，通過冷氣接觸表面冷卻以及在突然減壓期間液體表面的局部蒸發(fā)引起[55]。

“冰霧”技術(shù)是在潮濕的冷凍干燥機中填充冷氣體，以產(chǎn)生小冰粒的蒸氣懸浮液，當(dāng)這些冰粒接觸每個小瓶內(nèi)的流體界面時，它們會誘導(dǎo)成核的技術(shù)[56]。結(jié)合減壓技術(shù)，減壓冰霧技術(shù)可以顯著降低過冷度，在較高的零下溫度實現(xiàn)成核[57]。

7 結(jié)論與展望

本文研究了植冰技術(shù)在低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，分析了6種不同植冰方式的研究進(jìn)展，得到如下結(jié)論：

1）目前植冰方式主要分6大類，即通過接觸外壁形成局部過冷誘發(fā)成核，通過添加冰成核劑誘發(fā)成核，通過電極頭誘發(fā)成核、通過搖晃、振動以及超聲波等形式誘發(fā)成核，通過改變降溫速率誘發(fā)成核，通過惰性氣體改變壓力，或結(jié)合冰霧技術(shù)誘發(fā)成核；

2）添加冰成核劑、超聲波誘導(dǎo)、改變降溫速率以及改變壓力誘導(dǎo)等方法有一個缺點，無法控制在特定溫度下促進(jìn)成核，這不利于探究植冰溫度對細(xì)胞存活率的影響；

3）植冰技術(shù)的研究得到了很大的突破，在很多方面都提出了一些新的技術(shù)和改進(jìn)，但都存在一些不可控的因素和缺點,還需要進(jìn)一步研究。