28個中國紫蘇屬種質資源的染色體核型分析

孫浩男， 田 琳， 溫春秀， 劉冬云， 王 鑫， 李明陽

(1.河北農業大學， 河北 保定 071000;2.河北省農林科學院經濟作物研究所， 河北 石家莊 050000)

唇形科(Lamiaceae)紫蘇屬(PerillaLinn.)植物為一年生草本植物，主要原產于亞洲亞熱帶地區，世界各國均有引種栽培，我國的中南部和東南部是其野生資源的主要集中地區[1-3]。紫蘇屬植物集食用、藥用、油用、觀賞等一體，具有重要的經濟價值，其在中國的栽種歷史悠久，早在2000多年前，就有文獻記載古人食用栽培紫蘇[4-8]。截至今日，POWO(Plants of the world online)登錄的紫蘇屬現有1個種3個變種：紫蘇原變種(P.frutescensvar.frutescens)、野生紫蘇(P.frutescensvar.acuta)、回回蘇(P.frutescensvar.crispa)和微毛紫蘇(P.frutescensvar.hirtella)。但長期以來，紫蘇屬植物的分類問題仍飽受爭議，如耳齒紫蘇和白蘇是否該單獨劃分為變種，各學者通過形態學[8]、同工酶技術[9]等方面的研究，所持觀點不一，如今在我國《中國植物志》[1]中，仍將耳齒紫蘇(P.frutescensvar.auriculato-dentata)列為單獨的一個種。

染色體是遺傳信息的主要載體，而染色體分析是細胞學標記中常用的研究方法[10]。對染色體數目進行計數也可用來確定材料是否為多倍體[11]。目前，國內外有關紫蘇屬植物染色體形態和核型參數方面的研究已有報道。Akik等[12]曾對日本野生紫蘇、紫蘇原變種的染色體數目進行了鑒定，惠榮奎[13]、張旭[14]等也均有對我國部分紫蘇屬植物的染色體數目及核型進行了統計和測量。通過比較分析，不同地產的紫蘇資源在核型上具有不同程度的差異。因此，本文采用常規壓片法，對收集自我國多個地區的6個類型共28份材料的紫蘇屬植物進行核型分析，旨在為紫蘇屬植物資源的分類、鑒定及利用提供更多的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為產自我國的28份紫蘇屬植物材料的種子，進行萌發處理后取得根尖部位組織，名稱詳見表1，均由河北省農林科學院經濟作物研究所提供。

1.2 方法

將種子提前使用60℃溫水水浴30 min，再用200 mg·L-1赤霉素浸種進行8 h催芽，最后放在干凈的培養皿置于光照培養箱中進行培養。當種子發芽根長1～2 cm后，對幼嫩的根尖部位進行處理，處理方法參考周楊等[15]和孫桂芳等[16]的方法并進行改進：用冰水混合物預處理根尖部位24 h；轉入卡諾氏固定液中固定20～24 h(若固定后的材料不能立即使用，可暫時轉入70%酒精中，保存不超過1周)；將固定或保存好的材料使用蒸餾水沖洗3～4次；用1 mol·L-1的稀鹽酸60℃水浴10 min；再次沖洗3～4次后，放入蒸餾水中低滲10～30 min；切取根尖先端1～2 mm放置于載玻片上，用吸水紙吸去根尖表面多余水分，并用改良卡寶品紅染色30 min；擦拭多余染液及污漬，用鑷尖輕搗根尖后，蓋上蓋玻片進行壓片。

將制好的壓片放在Leica DM 4000顯微鏡下觀察，選取并拍攝有絲分裂中期且染色體分散良好的細胞進行拍攝，核型數據測量方法和處理方式等參考霍辰思等[17]，染色體計數和核型分析參考李懋學等[18-19]的方法，染色體類型按照Levan[20]的標準，核型類型分析參照Stebbins[21]的標準進行，核型不對稱系數按照Arano[22]的方法計算。

2 結果與分析

2.1 染色體數目與倍性

由表2可知，28份材料的染色體數目穩定，染色體倍性有兩種，其中3個多倍體紫蘇為四倍體，2n=4x=80，其余25份材料均為二倍體，2n=2x=40。

表1 供試紫蘇材料的基本信息Table 1 The information of the tested Perilla

續表1

2.2 染色體核型分析

28份紫蘇屬植物材料的主要核型參數見表2和圖2。結果表明，紫蘇屬植物的染色體組成類型主要為m和sm類型兩種，其中11個(YS-YL，ZS-AG，ZS-PY，ZS-CD，ZS-SXQ，ZS-ZY，BS-LZ，BS-WL3，BS-WL4，EC-WX，EC-WSZ)全部由m和sm類型的染色體組成，而其余17個材料由m，sm和st 3種類型組成，其st類型染色體數量為2～12條不等。在28個材料中，除EC-WSB有2對染色體帶有隨體，其他僅有1對帶有隨體，皆位于染色體短臂上，隨體的相對長度介于0.91%～2.84%之間。

28份紫蘇屬植物材料的核型類型較為豐富，有2A，3A，2B，3B 4個類型，15個(YS-YL，HH-GX，ZS-BL,ZS-AG，ZS-CD，ZS-HNH，ZS-SXQ，ZS-CZ1，ZS-QYB，BS-GS，BS-LZ，WL4，EC-WX，EC-WSB，EC-WSZ)為2A型，5個(ZS-BZ，ZS-PY，ZS-QYQ，WL2，EC-TB)為3A型,4個(ZS-TS，BS-YS，WL3，EC-EC)為2B型，4個(ZS-ZY，DZ-1，DZ-2，DZ-3)為3B型。28個材料的最長染色體/最短染色體值的范圍為1.50～2.80，臂比大于2的染色體占染色體總數的百分比為10%～65%，核型不對稱系數介于59.69%～68.52%之間。平均不對稱系數由大到小排列為：多倍體紫蘇(67.85%),回回蘇(66.10%),紫蘇(64.99%),白蘇(64.30%),耳齒紫蘇(63.61%),野生紫蘇(62.05%)。

表2 供試紫蘇材料的核型Table 2 Karyotype of the tested Perilla

圖1 供試紫蘇材料的有絲分裂中期染色體Fig.1 Mitotic chromosomes at metaphase of the tested Perilla

2.3 染色體進化趨勢分析

采用核型參數中的平均臂比和核型不對稱系數繪制核型散點圖[11,23]，圖中越靠近右上角表明進化程度越高，反之則越低。由圖2可知，28個材料中，DZ-2和DZ-3較為進化，ZS-SXQ和BS-LZ較為原始。

圖2 供試紫蘇材料的核型散點圖Fig.2 Karyotype coordinate image of the tested Perilla

2.4 聚類分析

根據秦丹等的方法[24]繪制聚類分析圖(圖3)。在遺傳距離為4.0時，28個紫蘇被劃為3大類，其中回回蘇、多倍體紫蘇全部歸為第一大類，而其二大類包含野生紫蘇和部分紫蘇原變種(包含白蘇和回回蘇)，第三大類僅包含2個紫蘇材料。相比較而言，ZS-SXQ和BS-LZ兩者與其他26個紫蘇的親緣關系較遠。

3 討論與結論

染色體數目是物種的重要特征之一[25]。本試驗采用常規壓片法，從細胞學標記方面對28個中國紫蘇屬植物的染色體核型進行了檢測結果表明，其數目穩定，存在二倍體和四倍體，染色體基數均為x=20，其中未發現B染色體，野生紫蘇、回回蘇、紫蘇原變種(包括白蘇和耳齒紫蘇)類型均為二倍體(2n=40)、多倍體紫蘇均為四倍體(2n=80)。這與惠榮奎[13]、張旭等[14]對中國紫蘇屬植物染色體數目的報道結果一致，但與Akik等[12]報道的日本紫蘇屬植物不同(野生紫蘇2n=2x=20)。從染色體倍性上看，紫蘇屬植物多為二倍體，而四倍體較少，但同為唇形科的薄荷屬(MenthaLinn.)不僅普遍存在染色體多倍化現象，也常見非整倍體[26]。在前人對鼠尾草屬(SalviaLinn.)的研究中發現，原產自國內外的鼠尾草染色體基數存在明顯的區別[10,27]，目前所報道的紫蘇屬染色體基數存在10和20兩種[12-14]，而本次供試的28個材料中僅發現一種染色體基數，推測與材料的生境地和來源有關。紫蘇屬植物的染色體類型共包含3種類型(m，sm，st)，以s和sm類型為主，28個紫蘇屬植物的核型公式不同，隨體的數目、大小及所處位置也存在差別，在前人對野生山丹(Liliumpumilum)[28]、波斯菊(Cosmosbipinnata)[16]的核型研究中也發現了相同的現象。但耿帆[29]認為這些差異也可能是由于預處理條件、染色體縮短程度、觀察和測量方法不同。

28個材料的核型類型十分豐富，出現了2A，3A，2B，3B 4種，不同類型的紫蘇屬植物在核型類型上存在一定差異：野生紫蘇和回回蘇為2A型，多倍體紫蘇為3B型，紫蘇原變種下的核型類型最為豐富，其中紫蘇、白蘇和耳齒紫蘇的皆含有2A，3A，2B型，在紫蘇中還額外發現了3B型。在張旭[14]對我國4種紫蘇屬植物的染色體核型研究中，共發現了2A，3A，3B 3種類型，而惠榮奎[13]僅發現了2A，2B兩種，本次試驗的材料與兩者的取材存在一定差異，推測這可能和紫蘇屬植物在我國的分布范圍較廣有關。張海洋[30]發現，栽培種芝麻(Sesamumindicum)的不對稱系數要明顯高于野生種芝麻，通過核型散點圖和聚類分析圖發現，28個紫蘇并不能明顯的進行分類，很可能是由于各地對于紫蘇屬植物引種栽培程度不一導致，因此，僅依靠核型參數對紫蘇屬植物進行分類較為困難。根據洪德元[31]和Stebbins[21]的觀點，植物染色體倍性進化的趨勢是由低到高，核型不對稱系數較大的類群較為進化，相反則較為原始。各類型紫蘇的平均不對稱系數上，多倍體紫蘇>回回蘇>紫蘇>白蘇>耳齒紫蘇>野生紫蘇，因此推測紫蘇屬內多倍體紫蘇和回回蘇的進化程度較高，而野生紫蘇較為原始，這與張旭等[14]、惠榮奎[13]研究結果不一致，推測與材料來源不同有關。和目前國內所報道的一些唇形科植物相比，紫蘇屬的染色體不對稱系數略高于獨一味屬(LamiophlomisKudo)、糙蘇屬(PhlomisLinn.)[32]，低于薰衣草屬(LavandulaLinn.)[33]，與部分荊芥屬(NepetaLinn.)[34]較為接近。因此，推測紫蘇屬在唇形科內的進化地位較為原始。

圖3 供試紫蘇材料核型聚類圖Fig.3 Cluster image of the tested Perilla based on karyotype

核型試驗中，成功與否最關鍵的步驟便是材料的預處理，對根尖進行染色體壓片前，多用到物理方法和化學方法來進行預處理，其中化學方法用到的藥劑多具毒性，如對二氯苯、秋水仙素、8-羥基喹啉等[19,35]。本試驗采用冰水混合物對紫蘇幼嫩的根尖進行預處理24 h，與前人所采用的試驗方法相比，處理時較為安全，更容易把握處理時間，同樣能夠獲得處于中期分裂相的細胞。低滲處理能夠增強染色體的分散程度[36]，由于多倍體紫蘇的染色體數量較多，壓片時染色體極易交疊，在預實驗中發現，進行低滲處理的根尖更便于觀察其細胞內的染色體形態和數量。

總體來看，紫蘇屬植物具有豐富的的染色體遺傳多樣性。目前，我國所報道紫蘇屬植物的染色體核型參數仍極為有限。而本次試驗得到的大多核型公式均為紫蘇屬內首次報道，且對鮮有研究的多倍體紫蘇的核型參數進行了補充，這些數據均為我國紫蘇屬植物的分類、鑒定等提供了大量理論參考。但本次采集的材料有限，尤其是回回蘇和野生紫蘇類型的樣本極少，還存在很大的局限性，若要在細胞學標記方面判斷紫蘇屬植物的分類及進化則需要更深層次的研究。