川西北高寒草甸植物根際促生菌篩選及其特性研究

楊婉秋， 敬 潔， 朱 靈， 高永恒1,*

(1.中國科學院成都生物研究所, 四川 成都 610041; 2.中國科學院大學， 北京 100049；3.中國科學院成都山地災害與環境研究所, 四川 成都 610041)

川西北高寒草甸位于青藏高原東緣，不僅是我國5大牧區之一，也是黃河上游重要的水源涵養區和集水區，在國家生態建設戰略總布局中具有極其重要的地位[1]。隨著全球氣候變化和人類活動的不斷加劇，川西北高寒草甸生產力降低等生態系統退化問題日趨嚴峻[2-3]，對當地畜牧業和黃河上游生態功能區造成了嚴重威脅。目前施肥是改善和恢復退化草甸的有效途徑[4]，但化肥的大量使用會導致土壤酸化板結、微生物群體結構破壞等一系列環境問題[5]。因此，研究開發對環境友好的新型肥料代替傳統化肥是當下提升高寒草甸生態系統功能的安全有效途徑。

植物根際促進菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是指生存于植物根際土壤中或者附生于植物根系上，能顯著促進植物生長發育及其對礦物質營養的吸收利用，并能緩解外界環境對植物的脅迫、提高植物抗病蟲害能力的一類有益微生物[6]。研究發現，PGPR可以通過溶磷、固氮和解鉀等方式促進植物對土壤中有效元素的吸收，提高植物抗病性及抗逆性，進而提高植物的生產力[7]。近年來，以根際促生菌作為接種劑的新型微生物肥料替代或部分替代化肥逐漸成為當前土壤肥料學的研究重點和熱點。

目前，有關草地植物根際促生菌的研究，在歐洲草原和我國北方草原進行了較廣泛的探索研究，內容涉及PGPR的菌株篩選和特性(溶磷、固氮、解鉀、分泌植物激素和信號類物質)、促生效果以及作用機理等方面[8-12]。近年來，在氣候惡劣的青藏高原高寒地區，高寒草地PGPR的研究引起了不少關注，對藏北高寒草原和高原北部的高寒草甸PGPR已有一些研究。其中，在西藏阿里的高寒草原篩選出固氮菌和溶磷菌等多種PGPR，并發現這些促生菌對植物有較好的促生作用[13]；在東祁連亞高山草甸篩選出的促生菌不僅具有較強的固氮、溶磷能力，還能分泌赤霉素、3-吲哚乙酸等[14-15]。但是，在PGPR的多功能特性、菌株種屬鑒定和促生機理等方面，仍有待更深入的研究[16]。此外，不少研究表明不同區域和不同植物的PGPR存在較大差異[17-18]，為選育出具有地區針對性的優良菌株，就需要在特定區域下進行相關研究。盡管如此，目前對青藏高原東緣的川西北地區高寒PGPR菌株篩選及其特性的研究鮮有報道。

本研究以川西北區域廣泛分布的四川嵩草(Kobresiasetchwanensis)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、異葉米口袋(GueldenstaedtiadiversifoliaMaxim)、多支黃芪(ScutellariabaicalensisGeorgi)和高山紫菀(Asteralpinus)5種高寒草甸植物為對象，從其根際土壤和根系中分離細菌菌株，并對這些菌株溶磷、固氮和解鉀特性進行定性定量分析測定，篩選出兼具多種特性的高效菌株，并利用分子生物學方法對其進行分類鑒定，以期為開發適用于川西北高寒草甸的生物菌肥提供優質的菌種資源，同時也為高寒地區農牧業的可持續發展和生態環境保護與建設提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣邛溪鎮(32°50′07″ N，102°35′34″ E)，平均海拔在3 500 m以上。該地為典型的大陸高原寒溫帶季風氣候，日照時間長，晝夜溫差較大，年均溫1.1℃，≥10℃年積溫322℃，年均積雪期達70 d以上，無絕對的無霜期。年平均降水量792 mm，降水主要集中在5—9月。研究區土壤類型以亞高山草甸土為主，其優勢種植被以垂穗披堿草和四川嵩草為主，伴生種有異葉米口袋、高山紫菀等[19]。

1.2 試驗材料

1.2.1土壤樣品的采集 土壤樣品取自5種主要的高寒草甸植物：莎草科的四川嵩草、禾本科的垂穗披堿草、豆科的異葉米口袋、多支黃芪和菊科的高山紫菀。樣品于2019年7月采自邛溪鎮圍欄禁牧5年的試驗樣地，采用5點取樣法(即分別選取樣方4個頂點和中心位置)采集5種植物根際(根系和土壤)樣品，采樣深度0～15 cm，各點樣品混合均勻后，暫時低溫保存于便攜式冰箱并迅速帶回實驗室，過2 mm土壤篩后于4℃低溫保存備用。

1.2.2主要培養基 細菌的分離和純化使用金氏培養基(King’s B medium，KB)和牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(Nutritional Agar medium，NA)，溶磷菌篩選培養基包括無機磷培養基(Pikovaskaia’s medium，PKO)和蒙金娜有機磷培養基，固氮菌的篩選使用無氮培養基(Nitrogen-free medium，NFM)，解鉀菌的篩選使用解鉀固體培養基，液體培養基除不含瓊脂，其他物質含量與對應的培養基相同[20]，菌株形態學特征鑒定使用LB(Luria-Bertani medium，LB)固體培養基，菌株的生理生化特性測定使用糖發酵培養基、明膠培養基和淀粉培養基[21-22]。

1.3 試驗方法

1.3.1植物根際促生菌分離和篩選 為了解PGPR在植物根際的分布，一般將根際分為3個部分，即根表土(Soil adhering to roots，RS)、根系表面(Rhizoplan or surface of roots，RP)和根內(Histoplan or interior of roots，HP)3個區域[23]。

用平板涂布法[21]在KB和NA培養基上分離3個區域的細菌。具體方法如下：抖落植物根系根際以外的土后，稱取1 g根系放入9 mL(0.85%)滅菌生理鹽水中，旋渦振蕩器5 000 r·min-1振蕩5 min，靜置20 min，上清液即RS 10-1稀釋液；無菌水沖洗振蕩后的根系3次，將根系放入試管中并加9 mL滅菌生理鹽水和5顆玻璃珠，振蕩方法同上，上清液即RP 10-1稀釋液；將制備完RP菌液的根系放入75%的乙醇溶液中1 min，無菌水沖洗3次，吸干表面水分，稱取0.5 g根系研碎，加入4.5 mL生理鹽水中并同上方法振蕩，上清液即HP 10-1稀釋液。按梯度稀釋法分別制備10-2，10-3，10-4，10-5梯度的根表土、根系表面和根內含菌懸液。然后將制備好的各濃度稀釋液用微量移液槍(槍頭滅菌)吸取50 μL分別接種在已滅菌的KB和NA固體培養基上，每個梯度3次重復，接種完成后的培養皿置于培養箱中，28℃恒溫培養3 d，篩選菌落形態大、生長速度快的菌株并利用交叉劃線法進行純化，獲得純菌株，將其保存于4℃冰箱中備用，定期進行轉接保存。

1.3.2溶磷菌株篩選及溶磷特性測定 將純化后的菌株分別點接至PKO培養基和蒙金娜培養基上，每株菌重復3次，以不接種的培養基為對照。用溶磷圈法定性測定溶磷特性，培養箱中恒溫28℃培養2 d后，分別測定其溶磷圈直徑D與菌落直徑d，依據溶磷菌株的D/d對溶磷能力做出定性判定。篩選出的溶磷菌株在液體培養基上進行培養，每個菌株設置3個重復，在28℃，180 r·min-1的搖床上培養4 d，將發酵液在4℃，5 000 r·min-1的條件下離心20 min，采用鉬藍比色法測定發酵液上清液中可溶性磷的含量。用紫外分光光度計測定吸光值，根據吸光值OD630在標準曲線上查找相對應的磷質量濃度，具體計算公式如下：

式中：P為標準曲線中查得的磷質量濃度(μg·mL-1)；V表示顯色液的體積(mL)；Ts表示分取倍數；V0表示發酵液的體積(mL)。

1.3.3固氮菌株篩選及固氮特性測定 采用乙炔還原法[24]測定菌株固氮酶活性。將純化后的菌株利用交叉劃線法接種到NFM固體培養基上，每個菌株接種3個培養皿，培養箱中恒溫28℃培養3 d后,記錄能在培養基中生長的促生菌菌株編號，即為有固氮能力的菌株。菌株的固氮酶活性采用乙炔還原法測定：挑選一環固氮菌接種至盛有5.0 mL半固培養基(2%～7%的固體培養基瓊脂含量，其他物質含量與NFM培養基相同)、容積為35.0 mL的西林瓶中，28℃恒溫培養2 d，用5.0 mL的醫用注射器抽取3.0 mL混合空氣，同時加入等量的C2H2氣體，封口膜密封，恒溫28℃培養2 d，抽取50 μL混合氣體注入氣相色譜儀(型號為GC7890F)氣體進樣柱內，觀察記錄C2H4的出峰時間和峰面積值，C2H4的標準氣濃度為138 mg·mL-1。氣相色譜儀工作條件為：150℃柱溫，120℃進氣樣溫度，130℃檢測器溫度，0.1 MPa氫氣氣壓，0.3 MPa氮氣氣壓，0.2 MPa空氣氣壓。測定菌株的固氮酶活性，其計算公式如下：

固氮酶活性[nmol(C2H4)·h-1·mL-1]=

式中：hx表示樣品C2H4峰面積值；C表示C2H4摩爾濃度(nmol·mL-1)；V表示西林瓶容積(mL)；hs表示標準C2H4峰面積值；t表示樣品培養時間(h)；24.9表示標準C2H4氣體在測試時的體積(mL)。

1.3.4解鉀菌株篩選及解鉀特性測定 將純化后的菌株點接至解鉀固體培養基上，培養箱中28℃恒溫培養5 d后，觀察菌落周圍是否出現水解圈，并測定透明圈直徑D與菌落直徑d，菌株的解鉀特性依據D/d做出定性判定。將解鉀菌株接種至NA培養基中，以不接菌的NA培養基為對照，在28℃，180 r·min-1的搖床上培養2 d得到發酵液。發酵液于8 000 r·min-1的冷凍離心機中離心8 min，取上清液測定溶液中可溶性鉀含量。利用原子吸收分光光度計測定溶液中可溶性鉀含量，其計算公式如下：

細菌溶解鉀的量(μg·mL-1)=
發酵液可溶性鉀含量-對照培養液可溶性鉀含量

1.3.5菌株形態學特征鑒定 利用交叉劃線法將供試菌株接種至LB固體培養基上，培養箱中28℃恒溫培養3 d，觀察并記錄各促生菌菌落形狀、大小、顏色等特征，此外，每隔24 h進行記錄菌株的生長速度，生長速度表示為：24 h為快、48 h為中、72 h為慢，通過革蘭氏染色法初步鑒定菌株。

1.3.6菌株生理生化特征 糖發酵試驗：將供試菌株分別接種在盛有葡萄糖、甘露糖和木糖的糖培養基中，每組重復3次，培養箱中恒溫28℃培養1 d后觀察記錄培養基的顏色變化，菌株產堿時培養基變為紫色，菌株產酸時培養基變為黃色，分別標記為陰性、陽性。

淀粉水解試驗：將供試菌株點接至淀粉培養基，對照處理為不接種的純培養基，恒溫28℃培養24 h后，在培養基表面滴加少量盧戈氏碘液，輕輕旋轉培養皿使其均勻鋪滿表面并觀察，若菌落周圍出現無色透明圈，則標記為陽性，反之標記為陰性。

明膠液化試驗：將供試菌株在明膠培養基上進行點接種，恒溫28℃培養，對照處理為純不接種培養基，培養1 d后對裝有菌株的培養基進行觀察記錄，若明膠液化，標記為陽性，說明明膠酶存在于該菌株內，反之標記為陰性。

1.3.7菌株16SrDNA基因序列分析 使用DP336離心柱型促生菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，保存于-20℃冰箱內。以總DNA為模板，利用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′來擴增16SrDNA近全長片段。PCR擴增采用50 μL反應體系：2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL，10umol·L-1引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL(20 ng左右)，滅菌去離子水補足至22.0 μL。PCR反應程序為：98℃預變性5 min，98℃變性10 s，55℃復性15 s，72℃延伸20 s，共循環35次，72℃終延伸5 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后送深圳海一時代基因有限公司測序。在GenBank(http:// www.ncbi.nlm.nih.Gov)中將測序所得16SrDNA序列與已報道細菌菌株進行同源性比較，找出同源性較高的序列進行相似性分析,使用序列分析軟件MEGA 7.0 進行多重序列比對，結合16SrDNA序列鑒定以及生理生化特征鑒定結果，并同時根據《常見促生菌系統鑒定手冊》[22]最終確定菌株種類。

1.4 數據分析

本試驗采用SPSS 24.0(IBM，Armonk，NY USA)統計軟件對不同菌株的溶磷、固氮和解鉀能力進行單因素方差分析和LSD多重比較；使用Origin 2019進行數據分析并制圖；利用軟件MEGA 7.0 進行Clustal W比對。

2 結果與分析

2.1 不同植物間根際菌株的分布

首篩得到59株菌株，經過復篩得到44株菌落形態大、生長速度較快的菌株，篩選結果如表1所示。四川嵩草、垂穗披堿草、異葉米口袋、多支黃芪和高山紫菀5種植物根際菌株分別占菌株總數的18.2%，18.2%，22.7%，27.3%和13.6%。總體來看，植物根際菌株資源比較豐富，RP，HP和RS 3個區域的菌株數量分別占比50.0%，27.3%，22.7%，整體呈現RP>HP>RS的分布趨勢。

表1 不同植物根際菌株分布情況Table 1 The distribution of strains in rhizosphere of plant

2.2 功能菌株的篩選及相關功能的測定

菌株溶磷特性測定結果：通過觀察菌株能否在培養基上產生溶磷圈，篩選出25株能溶解無機磷的菌株和24株能溶解有機磷的菌株，其中，有21株菌株能夠同時溶解無機磷和有機磷(圖1)。溶磷菌株的無機磷溶磷量在8.91～90.27 μg·mL-1之間，菌株間溶磷能力差異顯著，其中RPNY4的溶磷量最大，可達90.27 μg·mL-1，此外，RSNQ4，RPKS4，RPNZ3，RPKY3，RPNY4，RPNH5，HPKS3和HPKH5這8株菌株的溶無機磷量均達到60 μg·mL-1以上，具有高效的溶解無機磷能力。24株可溶解有機磷的溶磷菌株溶磷量介于10.58～75.13 μg·mL-1之間，其中，RSNQ4，RPNZ3，HPKS3，RPNY4，HPKH5和RPKQ4這6株菌株的溶磷量達到50 μg·mL-1以上。

圖1 菌株的溶磷能力Fig.1 Capacities of phosphorus-dissolving of strains注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

菌株固氮特性測定結果：從分離的44株菌株中，進一步分離篩選出20株固氮菌株，其固氮酶活性如圖2A所示。20株固氮菌株的固氮酶活性在5.23～64.87 nmol(C2H4)·h-1·mL-1之間，固氮酶活性在各菌株間差異顯著。固氮酶活性低于30 nmol(C2H4)h-1·mL-1的菌株占40%，固氮能力相對較差；固氮酶活性大于50 nmol(C2H4)·h-1·mL-1的有4株，分別為RSNZ3，RPNY4，HPKY3和HPKY4。

菌株解鉀特性測定結果：分離篩選共獲得21株解鉀菌株(圖2B)。解鉀菌株的解鉀量范圍在9.23～73.21 μg·mL-1之間，其中RSNY4菌株的解鉀量最大，為73.21 μg·mL-1，解鉀量大于60 μg·mL-1的有3株，分別為RSNY4，RPKQ5和RPKS4。

通過對菌株促生效應的測定結果綜合分析，最終篩選出12株兼具溶磷、固氮和解鉀的PGPR菌株(表2)，菌株編號為：RSNQ4，RPKQ5，RSNY4，RPNY4，HPKY3，RSNZ3，RPKZ4，RPNZ3，RPKS4，HPKS3，HPKH5，HPKY4，對上述菌株進行形態學觀察、生理生化特性及分子生物學鑒定。

2.3.1菌株形態學特征 表2顯示12個菌株形態學特性。大部分菌株生長速度較快，只有RPNZ3和RSNZ3生長速度慢；菌落顏色包括黃色和白色2種，只有RPNY4和RSNZ3為白色，其余菌株顏色均為黃色；大部分供試菌株的菌落形狀為橢圓形，只有RPNY4，RSNZ3，RSNY4和HPKS3菌株的菌落形狀為圓形；革蘭氏染色供試菌株的結果均為陽性。

圖2 菌株的固氮、解鉀能力Fig.2 Capacities of nitrogen-fixingand potassium-releasing of strains

表2 菌株形態學特征Table 2 Phenotypic characteristics and Gram staining results of strains

2.3 優質菌株的篩選

2.3.2菌株生理生化特性 各個菌株的生理生化特性如表3所示。在糖發酵試驗中，菌株RPNZ3，RSNY4和HPKH5菌株不能利用D-葡萄糖、D-甘露糖和D-木糖，其余菌株均可以利用3種糖發酵培養基；在淀粉水解利用試驗中，菌株RPKQ5，RPKS4，RSNZ3，RSNQ4，HPKS3和HPKY4可以進行水解，其余菌株則不能對淀粉進行水解利用；在明膠液化試驗中，所有供試菌株都可以在明膠培養基中將明膠液化。

2.3.3菌株16SrDNA基因序列 對PGPR菌株進行分子生物學鑒定發現，12株菌株的16SrDNA基因序列與選擇對比序列間的相似度均高于99%(表4)。它們分別歸屬于6個菌屬，其中RPKQ5，RPNZ3，HPKS3，HPKY4，HPKY3以及RPNY4這6株促生菌菌株均屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)；RSNQ4和RPKS4屬于沙雷氏菌屬(Serratia)；RSNY4，HPKH5，RPKZ4和RSNZ3分別屬于假單胞菌屬(Pseudomoas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、戴爾福特菌屬(Delftia)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)。

表3 菌株生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

表4 優良PGPR菌株的分子生物學鑒定Table 4 Molecular biology identification of excellent PGPR strains

3 討論

川西北高寒地區生態系統脆弱，退化的高寒草甸迫切需要綠色高效的肥料來改善土壤環境，修復已退化的生態系統。隨著現代生物技術的進步與發展，微生物菌肥為草地修復指明了方向。PGPR是微生物菌肥的重要來源，目前雖然由PGPR研發的菌肥已廣泛應用于農牧業生產中[25-26]，但是對高寒草甸PGPR的研究明顯不足。因此，從高寒草甸主要植物根際篩選促生菌菌株，為研發適合川西北高寒草甸使用的微生物菌肥提供了優良菌株資源，可為退化生態系統的恢復和管理提供新的途徑。

本研究對川西北高原四川嵩草、垂穗披堿草、異葉米口袋、多支黃芪和高山紫菀5種高寒草甸植物的根際促生菌進行了分離和篩選。共篩選出根際促生菌菌株44株，其中從豆科植物多支黃芪和異葉米口袋根際篩選出的PGPR多于其他3種植物根際，這與張英等[26]在西藏阿里地區高寒草原上的研究結果相似。這一現象可能與植物本身有關，不同菌株與寄主植物存在一定的專一性關系，如具有高效固氮功能的根瘤菌常見于一些豆科植物中[27]。從菌株在植物根際不同部位分布來看，其在根際表面分布最多，這與馬文文[28]和馬驄毓等[29]對高寒草地植物根際菌株分布規律的研究結果一致。菌株的這種分布模式一方面可能與根際特殊的生理代謝活動有關，使得某些根際分泌物有利于微生物分布在RP區域。Williams和Russo[30]研究發現植物根部分泌的甘露聚糖可以介導土壤微生物大量附著在植物根部表面；另一方面，根表作為根土界面，是根系相關活動影響最直接的部位，相比于RS和HP區域，能夠積累更多的根系分泌物以及土壤中的一些營養物質，為微生物生長提供了豐富的營養和良好的環境條件[27]。

通過測定菌株的溶磷能力發現，5種植物根際促生菌的溶磷量存在較大差異，四川嵩草根際篩選的菌株溶解無機磷能力要強于其他4種植物，而多支黃芪根際的菌株溶解有機磷的能力最強，菌株溶解無機磷和有機磷的能力均高于張英[13]對西藏高寒草原植物篩選的溶磷菌，這種結果可能是2個研究所選擇的植物種類不同所致。研究表明，菌株溶磷能力與植物種類有關：溶磷菌主要是通過釋放有機酸，如葡萄糖酸和2-酮葡萄糖酸，來溶解磷酸鈣和巖石中的磷，不同植物根際促生菌的種類和數量存在較大差異，所產生的有機酸的種類和濃度不同，菌株體內代謝碳源的途徑也不同，進而表現出植物間不同的溶磷效果[31]。此外，菌株的溶磷能力還與土壤養分有關，有研究發現溶磷菌在缺乏無機氮源的情況下，生長量和溶磷量顯著降低[31]，而川西北的高寒草甸土壤養分要顯著高于西藏高寒草原，這也就很好地解釋了本研究篩選的溶磷菌的溶磷能力強于張英等所篩選的溶磷菌[13]。本研究篩選的20株固氮菌中，其固氮酶活性在5.23～64.87 nmol(C2H4)·h-1·mL-1之間，整體上高于西藏阿里高寒草原植物根際固氮菌的固氮酶活性[13]，但低于東祁連高寒草甸植物根際菌株的固氮能力[32]，這可能由于3個不同研究區域氣候差異而造成的。固氮酶活性主要是指微生物體內鉬鐵固氮酶(由鐵蛋白和鉬鐵蛋白組成)等的酶活，它受外界氣候條件影響很大，特別是溫度[33]。一般來說，生長在氣溫低、生長季短的區域的植物，其固氮酶活性相對較低[34]。對解鉀菌株而言，從四川嵩草根際獲得的菌株其解鉀量要高于其他植物，解鉀量介于9.23～73.21 μg·mL-1之間。解鉀菌的解鉀作用受土壤礦物種類和含量、土壤類型、pH值、土壤溫度及環境中鉀離子濃度等多種因素影響，盛下放和黃為一[35]發現當土壤中鉀離子質量分數為26.5～75.8 mg·kg-1時，解鉀菌的解鉀能力最強,且解鉀量與礦粉粒徑密切相關,隨礦粉粒徑的減小而增加。此外，解鉀量還與寄主植物的種類有關，有學者對比研究菊科的加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis)和禾本科的白茅(Imperatacylindrica)根際促生菌發現，加拿大一枝黃花根際解鉀菌解鉀量要顯著多于白茅根際解鉀菌[36]。目前，鮮有關于青藏高原地區解鉀菌的報道，尚無法與青藏高原其他地區菌株解鉀量進行比較，但本研究中大部分解鉀菌的解鉀量大于26.5 mg·kg-1，表明篩選出的菌株具有較強的解鉀能力[35]。需要指出的是，本研究中菌株的溶磷、固氮和解鉀特性是在實驗條件下(28℃)的測定結果，而這一培養溫度下菌株的特性與高寒草甸自然環境下可能會存在一定差異。考慮到菌株在未來的實用性，篩選的12株多功能促生菌在自然環境下的促生特性以及對植物的促生效應有待進一步研究與驗證。

篩選出的12株菌株分別歸屬于不動桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、戴爾福特菌屬和寡養單胞菌屬，其中7株為假單胞菌目。在12株優良菌株中，有4株來自異葉米口袋，3株來自高山紫菀，其他每種植物只篩選到1～2株，因此，高山紫菀和異葉米口袋可作為篩選優良菌株的主要目標植物。目前，國內外學者篩選的PGPR菌株已涵蓋了多個菌屬，常見的有假單胞菌、芽孢桿菌等，但不同研究所篩選的菌株種類存在較大差異，有研究者從豆科植物苜蓿(Medicagosativa)的根際篩選出的促生菌主要為芽孢桿菌[37]。產生這種差異的原因可能與研究地區的生態環境和菌株的生長習性有關，林啟美[38]發現芽孢桿菌和假單胞菌在不同生態系統土壤中的數量存在較大差異，假單胞菌在各個生態系統分布比較廣泛，而芽孢桿菌在草地生態系統中較多。已有大量研究表明，從植物根際篩選的假單胞菌、芽孢桿菌等促生菌，尤其是生長在逆境中的促生菌，不僅對植物生長具有良好的促生效果，還具有抗旱性、抗鹽性及抗堿性等抗逆特點，這些優良的根際促生菌在農牧業上得到了廣泛的應用[39-40]。因此，本研究篩選的12株多功能菌株，有望在川西北地區草地修復與生產力維持中得到應用并收到明顯效果。

4 結論

川西北高寒草甸不同植物根際分布的促生菌數量不盡相同，四川嵩草、垂穗披堿草、異葉米口袋、多支黃芪和高山紫菀5種植物根際促生菌數量分別占比18.2%，18.2%，22.7%，27.3%和13.6%；植物根際促生菌在根際不同部位的分布數量存在明顯差異，呈現RP>HP>RS的分布特征。

篩選獲得44株菌株中，具有溶解無機磷和有機磷能力的菌株分別有25株和24株，具有固氮能力的菌株20株，具有解鉀能力的菌株21株。12株兼具溶磷、固氮和解鉀功能菌，歸屬于不動桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、戴爾福特菌屬和寡養單胞菌屬，可作為川西北高寒草甸專用新型生物菌肥的潛在優質菌種資源。