超高效液相色譜-串聯質譜法測定空氣中的丙烯酰胺

沈 權，胡凌霄,杜宇峰,朱麗波,陳 凱,馮加永

(1 寧波市奉化區環境保護監測站，浙江 寧波 315142；2 浙江省寧波生態環境監測中心，浙江 寧波 315142)

丙烯酰胺是由丙烯腈水化反應生成的無色透明晶體，分子結構簡式為CH2=CHCONH2。丙烯酰胺熔點84.5 ℃，沸點為125 ℃，極易溶于水、丙酮和乙醇。丙烯酰胺是重要的工業原料，是生成聚丙烯酰胺的中間產物。丙烯酰胺具有致癌、致畸、致突變的三致效應，而且丙烯酰胺蒸汽能夠通過皮膚、黏膜、呼吸道和消化道吸收，引起神經系統損傷和肝損傷，同時造成皮膚、眼睛等的腐蝕性損傷[1]。2002年，研究發現谷類、土豆、花生等食物經過高溫處理(烹飪、油炸、烘烤)過程會產生丙烯酰胺，它除了通過食用途徑對人類產生危害之外，在烹飪過程中隨著油煙等直接揮發也會進入到廚師的呼吸道，因此丙烯酰胺是食品安全領域重要的研究對象[2-3]。工業生產過程中，丙烯酰胺在高溫高壓條件下以蒸汽或者結合水蒸汽的形式在空氣中擴散，沿風向擴散距離可達數公里。我國工業場所空氣中丙烯酰胺的8 h時間加權容許濃度(PC-TWA)為0.3 mg/mL。

常用的檢測丙烯酰胺的方法有氣相色譜法[4]、氣相色譜質譜法[5]、高效液相色譜法[6]、高效液相色譜質譜法[7]等。丙烯酰胺屬于熱不穩定性物質，采用氣相色譜法檢測時常常需要使用衍生方法提高其穩定性，常用的衍生方法有溴化衍生法、2-巰基苯甲酸衍生法[8]等，衍生之后用電子捕獲檢測器(ECD)、氫火焰檢測器(FID)或者質譜檢測器(MS)檢測。高效液相色譜法-紫外檢測器檢測丙烯酰胺無需衍生化，但是紫外檢測器作為廣譜性檢測器選擇性不夠，容易出現假陽性。

本文建立了一種水吸收-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測空氣中丙烯酰胺的方法，空氣樣品采用水吸收的方法采集，過濾后直接進入超高效液相色譜-串聯質譜檢測，具有前處理簡單、方法快速、準確度高等特點，適用于污染區域空氣中丙烯酰胺的檢測。

1 實 驗

1.1 儀器、試劑、材料

Acquity UPLC色譜儀，美國Waters 公司，采用的色譜柱為ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；Quattro Premier XE三重四級桿質譜儀，美國Waters 公司；小流量空氣采樣器，山東青島嶗應有限公司(流速范圍為0.1～1.0 mL/min；Acquity)UPLC系統，美國Waters 公司；Quattro Premier XE三重四級桿質譜，美國Waters 公司。

一次性使用無菌注射器(1 mL)，浙江玉升醫療器械有限公司；水相針式濾器(13 mm×0.2 μm)，上海安譜科學儀器有限公司；多孔波板吸收管(100 mL)，浙江星云玻璃儀器生產公司；所有玻璃容器使用前均經過清水清洗3次，甲醇、乙腈分別清洗3遍以上，再用去離子水清洗3遍以上，烘干待用。

丙烯酰胺固體標樣(99.5%，優級純)，國藥集團；色譜純乙腈、甲酸，美國TEDIA公司；色譜純甲酸，美國Fisher Scientific公司；Mill-QG去離子水 (18.3 MΩ)，美國Millipore公司。

丙烯酰胺標準溶液：用甲醇/水為7:3的溶劑標準配置1 μg/mL的丙烯酰胺儲備液備用。然后用7:3的甲醇/水溶劑配置5個濃度標準的(1.0，5.0，10.0，50.0，100 μg/L)標準曲線待用，在4 ℃條件下避光保存，一個月內有效。

1.2 樣品采集、前處理

樣品采集自寧波市鎮海區某丙烯酰胺生產廠附近，該區域有兩家丙烯酰胺年產量在10萬噸以上的生產廠，占全國生產量30%以上。15個采樣點分別位于廠區內、廠區外50 m、100 m、500 m、1 km附近，選取了四個方向作為比對。

空氣樣品用一個內裝50.0 mL純水的多孔玻板吸收管以0.5 L/min流量、采氣45 min取得。記錄采樣時的溫度和大氣壓力及采樣體積。采樣后，密封采樣玻璃管。采樣時應采集全程序空白。采集后應盡快分析。如不能及時分析，應在4 ℃條件下避光保存，不超過7天。

樣品運回實驗室后采用一次性進樣針吸入約1 mL樣品,經過0.2 μm的水相針式濾器過濾后直接注入液相進樣小瓶中待測。

1.3 色譜方法

采用梯度洗脫的方式，流動相流速為0.2 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣體積為10 μL，流動相梯度見表1。其中，A相為甲醇，B相為0.1%甲酸/水溶液。

表1 流動相梯度

1.4 質譜方法

為保證在最優條件下進行條件優化，采用流動注射模式(Flow Injection Analysis，FIA)進行質譜條件的優化。Q1全掃描范圍為60～80 m/z，單位分辨率掃描時間為0.2 s。實驗中最終采用的電離模式為ESI正離子模式，最終電離條件如表2。MRM模式中采用的碰撞能量為10 eV，定量反應通道為72～55 m/z，定性反應通道為72～44 m/z,單個反應通道掃描時間為0.2 s(表2)。

表2 質譜條件

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

丙烯酰胺的水溶性和極性較強，而且分子量較小，在普通反相色譜柱中保留較弱，峰形拖尾嚴重。HILIC色譜柱是近年來用來改善在反相色譜中保留較差的強極性物質的色譜柱類型，用反相色譜的形式來完成正相色譜的工作。HILIC色譜柱固定相為強極性，需要配合高比例有機相的流動相，而有機相比例的提高有利于提高電噴霧的揮發性，從而提高了質譜的靈敏度。本實驗對C18色譜柱和HILIC色譜柱進行了對比，丙烯酰胺在C18色譜柱中保留困難，而且穩定性和重復性不好，而丙烯酰胺在HILIC色譜柱中峰形較好。

在溶劑匹配試驗中，丙烯酰胺在乙腈/0.1%甲酸溶液流動相中與甲醇/0.1%甲酸溶液相比，分離度差距不大，但是甲醇更適用于HILIC色譜柱，對應的質譜靈敏度更高，實驗中采用了甲醇/0.1%甲酸作為流動相。

圖1 丙烯酰胺總離子流色譜圖

2.2 質譜條件優化

表3 質譜反應通道

為了更符合實際模式，單質譜模式下，以1.0 ug/mL的丙烯酰胺為毛細管流動注射模式進行質譜條件優化，流動相條件為7:3的甲醇/0.1%甲酸水溶液。首先通過ESI/APCI的比較，SIM模式下發現ESI中丙烯酰胺的靈敏度明顯好于APCI，這與ESI更適用于極性物質的結論相符。在ESI正離子模式中，SIM模式下發現質荷比為72的分子離子響應較強，碰撞能量超過20 eV時丙烯酰胺碎片很多且均不是很強，說明丙烯酰胺分子并不是很穩定。在10 eV情況下72-55反應通道最強，作為定量通道；72-44為次要通道，作為定性通道 。MS優化參數中，影響最大的為錐孔電壓，其中20～30 V為最佳優化區間，40 V以上信號消失，最終優化值為25 V，其他參數影響不明顯。

2.3 前處理優化

一般工作場所中常用的丙烯酰胺采樣方法為硅膠管采樣法，這種方法要采用一次性的硅膠管來采集空氣中的丙烯酰胺。它最大的弊端是存在前端要不要采用脫脂棉脫水的問題：如果脫水，丙烯酰胺會隨水蒸氣一起被脫脂棉聚留，如果不脫水則會導致水分進入采樣管導致堵塞，在實際實驗中操作起來較困難。本實驗采用水吸收法來采集空氣中的丙烯酰胺，串聯兩根U型管以檢測該方法的穿透率，當空氣中丙烯酰胺濃度為0.39～1.54 mg/m3時，采樣效率達到97.5%～100%，因此水吸收法可以用于空氣中丙烯酰胺的采集且方法更簡單、方便和快捷。

2.4 檢出限、測定下限和線性范圍

按照《環境監測 分析方法標準制修訂技術導則》(HJ 168-2010)的相關規定，連續分析7個接近于檢出限濃度的實驗室空白加標樣品，計算其標準偏差S。用公式：MDL=St(n-1，0.99)(連續分析7個樣品，在99%的置信區間，t(6，0.99=3.14))進行計算。其中：t(n-1，0.99)為置信度為99%、自由度為n-1時的t值；n為重復分析的樣品數。測定下限為4倍檢出限。丙烯酰胺在水中的方法檢出限分別為0.5 μg/L，對應的空氣中的方法檢出限為1.11 μg/m3，測定下限為4.44 μg/m3，能夠滿足實際環境監測的需要。在水中濃度1.0～3000 μg/L范圍內，對應空氣中濃度范圍為相關系數(R2)范圍為0.9995，線性方程為y=240.3x+227.8，線性良好。

2.5 準確度和精密度

實驗室空白和方法空白均沒有丙烯酰胺檢出。儀器和方法的穩定性通過5天內每日重復取兩種濃度(10.0 μg/L，100 μg/L)5個空白樣品加標樣來驗證，次偏差(run to run)為4.9%～9.7%，日偏差(day to day)為6.1%～13.2%。用實際樣品進行10.0、100、1000 μg/L低中高三個濃度加標，采用加標回收率評價方法準確度，采用日內標準偏差和日間標準偏差來評價方法的精密度。日內標準偏差為同日內按照樣品分析的全部步驟平行測定6份同樣濃度加標樣品中目標物的濃度計算其相對標準偏差，日間標準偏差為連續6日每日測定同樣濃度加標樣品中目標物的濃度計算其相對標準偏差。對于10～1000 μg/L濃度范圍的加標水樣進行精密度實驗，日內標準偏差為3.9%～8.7%，日間標準偏差為6.5%～17.5%，符合空氣分析中一般低于30%的要求。按本方法確定的分析測定條件及步驟，選取實際樣品進行三種不同濃度(10.0、100、1000 μg/L)的加標實驗，回收率范圍在81.1%～87.4%。說明本方法的準確可靠。

2.6 實際樣品檢測

在15個實際樣品的檢測之中，丙烯酰胺的檢出濃度范圍為ND-1.54 mg/m3。從檢測數據來看，丙烯酰胺在廠區周圍內污染較為嚴重，其污染情況受風向和距離的影響較大。

表3 空氣中丙烯酰胺的含量

3 結 論

本文建立了水吸收-UPLC-MS/MS的方法檢測空氣中的丙烯酰胺，與常規的硅膠管吸附-氣相色譜法檢測方法相比，該方法避免了復雜的前處理和衍生過程，節約了試劑和時間，同時保證了足夠的靈敏度，適用于空氣中丙烯酰胺的檢測。