精喹禾靈對水稻的生長、CPR酶活性及抗氧化系統的影響研究*

張杰皓，孫術鑫，張 艷，馮立志，劉媛媛，張 瓊

(濱州學院生物與環境工程學院，山東 濱州 256603)

農藥是農業生產中必不可少的生產資料，但是在農業生產轉向集約化生產發展的過程中，長期過量及不科學地使用農藥會導致環境中農藥產品(例如除草劑)殘留并沿著生物鏈進行富集[1]。精喹禾靈，化學名稱2-[4-(6-氯-2-喹噁啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯，是一種有較好選擇性的除草劑[2]。它被雜草葉片吸收后，可以擴散到整個雜草植株體內并在分生組織內累積，抑制雜草植株對脂肪酸等物質的合成，還抑制乙酰C0A羧化酶的生成，破壞了分生組織的生長進而使得雜草死亡[3]。然而，精喹禾靈也是一種有毒化學物質，隨著它的廣泛使用，它對環境和生物的危害也逐漸顯露出來，已證實精喹禾靈和它的代謝物精喹禾靈酸均具有生殖毒性和肝毒性[4]。為防止精喹禾靈對生態和健康造成威脅，歐盟已禁止使用該農藥，大多數的發達國家設定了相應的殘留限量，但在我國它仍廣泛應用于豆類等作物的雜草防除[5]。當前，國內常用HPLC法檢測精喹禾靈在土壤和作物體內的殘留[3,6]。

本研究以精喹禾靈為主要的研究對象，選用水稻作為受試生物，通過觀察分析不同濃度下的精喹禾靈對水稻的生長、代謝酶活性及抗氧化系統的影響，深入探討這種除草劑對非靶標植物水稻的毒性和機理，為它的安全施用提供科學依據。

1 實 驗

1.1 實驗材料

水稻種子(秀水63號)取自中國水稻研究所(中國杭州)，除草劑精喹禾靈購自百靈威公司(中國北京)，各種抗氧化酶的測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(中國南京)，其他各種生化試劑都是分析純度，此外還有營養土，培養皿，泡沫箱等實驗材料。

1.2 水稻幼苗培育和外觀生長特征觀察

選取圓潤飽滿的水稻種子，用3%的雙氧水浸泡消毒25 min后用清水沖洗數遍。消毒后的種子平鋪于培養皿中，加入20 mL蒸餾水覆蓋種子，室溫下在黑暗環境中培養5 d。5 d后選取已發芽的種子均勻撒入營養土中，噴水澆濕，在日夜溫度25 ℃/20 ℃，光暗比為12 h/12 h的環境中培養10 d，每天澆水一次。待水稻幼苗長到二葉期，選取葉長為1.5～2.0 cm的秧苗進行后續實驗。

精喹禾靈原藥溶于丙酮中，經稀釋后按照不同濃度，一次性噴灑加藥(助溶劑丙酮的濃度<0.5%)。所設的精喹禾靈的濃度梯度如下：10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，同時設置空白對照組，每個處理組三個平行，連續培養3周。水稻幼苗經過轉接后，每周采樣一次，記錄各處理組的根長、莖長、鮮重等形態外觀指標。

1.3 精喹禾靈對水稻代謝酶CPR活性的影響

為了有足夠的生物量，采集生長了3周的水稻秧苗，對代謝酶活性，抗氧化酶活性等進行檢測。測定CPR活性時，首先需要提取微粒體，本實驗采用差速離心方法制備水稻細胞色素P450微粒體。接著利用酶標儀測定NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)的活力，具體做法可參照相關文獻[7]。蛋白的測定采用考馬斯亮藍法。NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)活力的計算公式如下：

CPR活力(nmol·min-1·mg-1protein)=ΔOD550×1000/(21.1×蛋白濃度)

1.4 精喹禾靈脅迫下的水稻體內抗氧化酶活性測定

在不同采樣時間采集各處理組水稻幼苗莖葉組織5 g，放入已預冷的研缽中加液氮快速研磨成粉。加入100 mM磷酸緩沖液(pH 7.5)后將樣品移至離心管內，8000 r/min，4 ℃下離心15 min，去上清，將沉淀放入液氮中5 s后，立即取出置于冰箱存放30 s，取出后自然解凍。反復凍融3次后，用高速冷凍離心機在3500 r/min離心15 min，取上清液進行抗氧化酶活性測定。酶的測定嚴格按照試劑盒說明書要求進行，過氧化物酶(POD)測定使用紫外比色法；過氧化氫酶(CAT)使用可見光法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法。各抗氧化酶的活性最后均按樣本蛋白濃度進行均一化處理。

2 結果與討論

2.1 水稻幼苗在不同精喹禾靈濃度下的生長情況

本實驗共設六組不同的處理組，各處理組精喹禾靈的濃度分別為0 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，分別編號為①、②、③、④、⑤、⑥。表1是對各處理組不同暴露時間(4 d，8 d，12 d)下外觀形態(幼苗的根長、莖長及鮮重)的實驗數據的整理。

表1 不同濃度精喹禾靈處理下水稻幼苗根長、莖長及鮮重

由表1可以得知，當除草劑精喹禾靈的加藥濃度低于100 μg/L時，水稻幼苗的根長、莖長及鮮重都較空白組的水稻幼苗更長、更重；當精喹禾靈的濃度超過200 μg/L時，與空白相比，水稻幼苗的根長、莖長及鮮重都明顯受到抑制。從上表數據可得到如下結果：低濃度的精喹禾靈是可以促進水稻幼苗的生長發育的，但是隨著除草劑精喹禾靈濃度的增高，這種促進現象則會轉為抑制效應，阻礙水稻幼苗的正常生長。可能的原因之一就是精喹禾靈影響了水稻的抗氧化防御系統，打破了細胞內活性氧(ROS)的產生與消失的動態平衡狀態。

圖1 不同濃度精喹禾靈處理組水稻幼苗的蛋白含量

與生長情況類似，隨著精喹禾靈濃度的變化，植株總蛋白含量的變化也呈現出先升高后降低的趨勢，如圖1所示。在精喹禾靈濃度較低時，與空白對照組相比，精喹禾靈刺激水稻的蛋白合成。但當精喹禾靈濃度較高時，對水稻的蛋白合成抑制效應顯著。這就表明由于低濃度農藥的刺激作用，水稻蛋白質的合成量有升高趨勢，且隨著濃度增加，增加的值越大；而高濃度農藥對水稻的毒害效果明顯，首先是蛋白含量明顯下降，這將對水稻幼苗的一系列生理生化反應造成影響。

2.2 水稻在精喹禾靈脅迫下的代謝酶活力變化

NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)被認為是細胞色素P450酶系的核心成分之一。細胞色素P450酶系是一種血紅素氧化酶系，普遍存在于動物、植物和微生物中，重要特征之一是具有生物合成功能[8]。大量證據表明，細胞色素P450酶系參與許多除草劑的代謝。細胞色素P450酶系不僅可以催化植物體內某些重要的內源性物質的生物合成，而且還可以參與許多有毒物質和外源性物質，包含殺蟲劑，除草劑，藥物，環境污染物的解毒和代謝[9]。此前對不同農藥的植物代謝的研究發現：PBO與阿特拉津共同處理下，離體抑制試驗表明CPR酶活力幾乎被抑制一半。這項結果間接表明了水稻細胞色素P450酶系對阿特拉津的代謝具有重要作用[7]。因此，測定不同精喹禾靈濃度處理的水稻細胞中NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)活力具有重要意義，可在一定程度上反映水稻幼苗對精喹禾靈的脅迫響應。

該實驗的測定結果如圖2所示。精喹禾靈處理后，水稻細胞的CPR活力相比不加藥的空白對照組顯著增強，精喹禾靈濃度在100 μg/L以下時，水稻CPR活力為1.32 nmol·min-1mg-1蛋白，是不加藥對照組CPR活力的2.78倍。并且隨著精喹禾靈濃度的增高，水稻CPR活力也有明顯的提高，這就表明細胞色素P450酶系作為代謝酶參與了水稻對除草劑精喹禾靈的代謝。

圖2 精喹禾靈對水稻NADPH-細胞色素P450還原酶活力的影響

2.3 水稻在精喹禾靈脅迫下的抗氧化酶活性變化

過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是生物體抵御氧化損傷的兩種重要酶。其中，過氧化氫酶(CAT)是一種血紅素蛋白，能與過氧化物酶(POD)協同催化過氧化氫生成H2O和O2，從而降低過氧化氫對細胞的氧化損傷。本實驗對水稻幼苗丙二醛(MDA)含量、過氧化物酶(POD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力進行了分析。由圖3可以看出，在本試驗中，水稻細胞內POD活性隨著除草劑精喹禾靈加藥濃度的增加而顯著增高，在100 μg/L精喹禾靈脅迫下，水稻POD活性是不加藥的對照組的2.05倍。由圖4可以看出，水稻細胞內的CAT活性在低濃度精喹禾靈影響下顯著提高，在精喹禾靈濃度為100 μg/L脅迫下，水稻CAT活性是不加藥的對照組的1.90倍，但在高濃度精喹禾靈脅迫下，水稻細胞內的CAT活性出現了降低趨勢，可能原因是高濃度的精喹禾靈脅迫使得水稻細胞CAT活性不能被成功激活。這也可能是水稻暴露于高濃度精喹禾靈處理組時生長出現明顯抑制的原因(表1)。

圖3 不同濃度精喹禾靈處理組水稻幼苗的POD活力

圖4 不同濃度精喹禾靈處理組水稻幼苗的CAT活力

MDA是生物體內脂質過氧化的重要產物，其含量的升高表明機體受到了氧化脅迫，因此通常用于反映生物體在受到各種外界影響后細胞的氧化損傷程度。由圖5可以看出，精喹禾靈處理組的MDA含量與不加藥的對照組相比均顯著升高，在精喹禾靈濃度為100 μg/L時，水稻MDA含量是不加藥的對照組的4.18倍。

圖5 不同濃度精喹禾靈處理組水稻幼苗的丙二醛(MDA)含量

綜合上述抗氧化酶活性和MDA含量的結果，我們認為精喹禾靈的脅迫給水稻造成了嚴重的氧化損傷(圖5)，但農藥誘導的水稻體內抗氧化酶活性的增加(圖3，圖4)，卻在一定程度上緩解了活性氧自由基(ROS)對水稻細胞的氧化損傷，在外觀上還表現為低濃度的生長刺激效應(表1)。最新的研究表明，除了農藥外，重金屬的添加也有類似的效應。如張盛楠等研究發現：在Cd脅迫下，添加三種外源物質均導致水稻根系中MDA含量增加，外源添加物可顯著增加水稻幼苗POD、CAT的活性[10]。

3 結 論

通過本次精喹禾靈對非靶標植物水稻的生長和體內各種酶活性的調研和分析，得出如下幾點主要結論：

(1)從水稻生長的外觀特征和蛋白含量來看，低濃度的精喹禾靈是可以促進水稻幼苗的生長發育的，但是隨著除草劑精喹禾靈濃度的增高，這種促進現象則會轉為明顯的抑制效應，阻礙水稻幼苗的正常生長。因此，建議該除草劑的施用應盡量維持在低濃度，這樣既能達到預期效果也更加的環保。

(2)在精喹禾靈的脅迫下，水稻NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)活力相比于空白對照組顯著增強，這就表示細胞色素P450酶系作為代謝酶參與了水稻對除草劑精喹禾靈的代謝解毒機制。

(3)與空白對照組進行對比，在本次實驗濃度范圍內，經精喹禾靈處理的水稻體內POD和CAT活性以及MDA含量均有所增加，表明精喹禾靈對水稻細胞造成了嚴重的氧化損傷。當精喹禾靈噴灑濃度較高(大于200 μg/L)時，CAT活性的刺激現象有所下降，但POD活性仍然有所升高。