圓齒野鴉椿果皮多糖的提取及其抗炎活性研究

黃 維， 郭夢云， 王玉啟 ， 林金壘， 張宇翔， 鄒雙全

(1.福建農林大學 生命科學學院,福建 福州 350004; 2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350004)

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)為省沽油科落葉灌木或小喬木，是優良的觀賞植物[1-2]。同時圓齒野鴉椿果也是福建的民間傳統藥材，具有行氣鎮痛、消腫散結的功效，多用于治療偏頭痛、胃痛、腸炎等[3-4]。現代化學和藥理學研究發現，圓齒野鴉椿果皮中主要含有三萜、黃酮、色原酮、多酚、多糖等成分[5-7]，藥用價值有抗炎、抗癌、抗氧化等[8-11]。多糖是圓齒野鴉椿果皮的主要成分之一，本研究對圓齒野鴉椿果皮多糖提取工藝及其單糖組成進行研究與分析，并對多糖抗炎功效進行檢測，可為圓齒野鴉椿多糖資源的開發利用提供理論依據。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)，2018年10月于福建省邵武市天成巖采集果實，經福建農林大學鄒雙全研究員鑒定為圓齒野鴉椿。果實曬干后分離出果皮和種子，果皮以中藥打粉機粉碎后過篩，取粒徑小于0.42 mm的樣品備用。

從中國科學院上海細胞庫購入RAW264.7巨噬細胞。鼠李糖、半乳糖、核糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖購于上海安譜實驗科技股份有限公司(純度≥98%)；葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖購于北京壇墨質檢科技有限公司(純度≥98%)；巖藻糖購于成都曼斯特生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DEAE-52纖維素和內毒素脂多糖(LPS)購于北京索萊寶科技有限公司；地塞米松購于上海生工生物；DMEM高糖培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(青鏈雙抗)均購自美國Hyclone公司；前列腺素E2(PGE2)ELISA試劑盒購于上海酶聯生物公司；NO檢測試劑盒購于江蘇碧云天公司；色譜級乙腈購于德國默克公司。硫酸、苯酚、氯仿、三氟乙酸、無水乙醇、NaOH、NaCl均為分析純試劑。

Millipore Synergy-UV超純水機，美國密理博公司；Agilent 1260高效液相色譜(HPLC)儀，美國安捷倫公司；RE52CS-2旋轉蒸發儀；Thermo Varioskan Flash多功能酶標儀，美國默賽飛公司。

1.2 圓齒野鴉椿果皮多糖的提取

稱取經石油醚回流脫脂后的圓齒野鴉椿果皮干粉2.0 g，置于具塞錐形瓶中，以不同的液料比制成混合溶液后，加入超聲波容器中，按設定的溫度、功率，提取相應的時間，獲得不同條件下果皮多糖的提取液。

根據實驗條件，選取單因素液料比(10 ∶1、 15 ∶1、 20 ∶1、 25 ∶1、 30 ∶1，mL ∶g)、提取時間(30～120 min)、提取溫度(30～70 ℃)、超聲波功率(100～500 W)分別進行試驗，每一組設置3個重復實驗，探討這4個因素對多糖提取得率的影響。在單因素試驗的基礎上，設計4因素3水平響應面中心組合實驗，使用Design-Expert 10.0.2軟件對其結果進行優化。

1.3 圓齒野鴉椿果皮多糖的分離純化

以優化后的提取方案進行圓齒野鴉椿果皮多糖提取，經過乙醇沉淀后獲得圓齒野鴉椿果皮粗多糖。將50 mg 圓齒野鴉椿果皮粗多糖溶解于蒸餾水中，攪拌均勻后上樣于DEAE-52纖維素層析柱，用0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9 mol/L的NaCl溶液依次進行梯度洗脫，每個濃度洗脫液200 mL，控制洗脫液流速為1.0 mL/min，收集洗脫液，每管5 mL。測定洗脫液在490 nm處的吸光度值，繪制洗脫時間與吸光度值的關系曲線，合并單一對稱峰的洗脫液，采用旋轉蒸發儀濃縮至10 mL左右，用相對分子質量3 000的透析袋在流動的純水中透析過夜去除NaCl，再進行冷凍干燥，收集得到圓齒野鴉椿果皮多糖的一個主要成分，將其標記為PEP。

1.4 多糖的分析測定

1.4.1多糖中糖、蛋白和糖醛酸質量分數測定 采用苯酚-硫酸法測定果皮多糖中糖的含量，以葡萄糖為對照品繪制標準曲線，測試波長490 nm[12]；采用考馬斯亮藍染色法測定多糖中蛋白質含量，以牛血清白蛋白作為標準蛋白，測試波長為595 nm[13]；采用硫酸-咔唑法測定多糖中糖醛酸含量，以半乳糖醛酸為標準品，繪制標準曲線，測試波長523 nm[14]。

1.4.2多糖分子質量的測定 稱取分子質量1～700 ku的葡聚糖為標準品，采用高效凝膠滲透色譜(GPC)法測定PEP的數均相對分子質量(Mn)、重均相對分子質量(Mw)，Z均相對分子質量(Mz)[15]。色譜條件: Shodex OHpak SB-806HQ色譜柱(300 mm×8.0 mm，5 μm)，流動相為超純水(0.02%疊氮化鈉)，pH值6，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，示差折光檢測器，進樣量20 μL。

1.4.3單糖組成的測定 精密稱取葡萄糖5.0 mg、鼠李糖 4.6 mg、阿拉伯糖5.0 mg、半乳糖醛酸 4.2 mg、半乳糖4.9 mg、巖藻糖4.7 mg、核糖5.2 mg、甘露糖4.6 mg、木糖4.3 mg和葡萄糖醛酸4.8 mg于磨砂具塞試管中，用10%甲醇定容至5 mL，混合均勻后得到標準品溶液。

精密稱取冷凍干燥后的PEP 10.0 mg，加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，于100 ℃下水解2 h，冷卻后用3 mol/L NaOH中和至pH值為7，然后用蒸餾水定容至5 mL，得到水解后的PEP樣品。

取標準品溶液和水解后的樣品溶液各200 μL，分別加入0.3 mol/L NaOH溶液200 μL，0.5 mol/L PMP 200 μL，混合均勻后置于70 ℃的水浴加熱100 min，冷卻后依次加入0.3 mol/L鹽酸和蒸餾水各200 μL。混勻后加入1 mL氯仿萃取，之后棄去氯仿層，再重復萃取3次，上清液以0.22 μm濾頭過濾后進行HPLC檢測[16]。

1.5 多糖的抗炎活性研究

采用LPS誘導巨噬細胞RAW264.7構建炎癥反應細胞模型，考察PEP給藥后對細胞存活率和炎癥因子分泌量的影響。用DMEM培養基(含1%青鏈雙抗和10%胎牛血清)培養RAW264.7細胞。設置調零孔(僅有培養基，無細胞存在)為對照，以每毫升2×105個RAW264.7細胞接種至96孔板上，每孔180 μL細胞液。培養過夜后，將有細胞的孔劃分為模型組、空白對照組、給藥組和陽性對照組，每組各5個復孔。空白對照組和模型組給予含0.1%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養基，陽性對照組以200 mg/L 給予地塞米松，給藥組分別以1、 2、 5 和10 g/L PEP給藥，每組所加入的體積均為20 μL。除空白對照組外，陽性對照組和給藥組以藥物作用2 h后，再以LPS(終質量濃度為 1 mg/L)刺激22 h[17]。

取一定量的細胞培養液，用NO試劑盒對RAW264.7細胞上清液NO的分泌情況進行檢測，用ELISA試劑盒對RAW264.7細胞上清液中炎癥因子PGE2 的表達量進行檢測。取RAW264.7細胞于96孔板上，每孔180 μL細胞液，于恒溫箱培養24 h后，每孔加入10 μL 5 g/L的MTT溶液，繼續培養 4 h 后，棄去上清液，向細胞中加入150 μL DMSO溶液振蕩溶解10 min，測定波長490 nm處的吸光度(A)，計算細胞存活率(%)=(A藥物-A調零)/(A空白-A調零)×100%，其中，A藥物表示經藥物處理孔中樣品的吸光度值，A調零表示調零孔中樣品的吸光度值，A空白表示空白孔中樣品的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 多糖提取的單因素試驗

為了探究多糖提取的最佳條件，分別采用不同的液料比、超聲波功率、提取時間和提取溫度來提取圓齒野鴉椿果皮多糖。圖1(a)為不同的液料比對提取得率的影響情況，其他提取條件為溫度40 ℃、超聲波功率300 W、提取60 min，發現液料比達到25 ∶1(mL ∶g)后，液料比繼續增加，多糖提取得率趨于穩定甚至略微降低，可能是由于液料比在超過一定比例后，多糖的溶出速度會變慢引起的。圖1(b)為不同超聲波功率對提取得率的影響，其他提取條件為液料比25 ∶1(mL ∶g)、提取溫度40 ℃、提取時間60 min，得出超聲波功率達到400 W時，多糖提取得率最大，當超聲波功率達到500 W時，提取得率下降，可能是超聲波功率過大會引起多糖降解。圖1(c)為研究不同提取時間對果皮多糖提取得率的影響，其他提取條件為超聲波功率400 W、溫度40 ℃、液料比25 ∶1(mL ∶g)，得出提取時間為120 min時，提取得率最高，提取時間超過120 min會導致多糖提取得率下降，可能與提取時間過長引起多糖結構破壞相關。圖1(d)研究了提取溫度在30～70 ℃間對提取得率的影響，其他提取條件為液料比25 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時間為120 min，得出提取溫度為60 ℃時，圓齒野鴉椿果皮多糖的提取得率達到最高，提取溫度進一步升高提取得率下降，可能與高溫會引起多糖降解有關。因此，選取提取液料比25 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時間120 min和提取溫度60 ℃作為響應面法試驗的中心值。

圖1 液料比(a)、超聲波功率(b)、提取時間(c)和提取溫度(d)對圓齒野鴉椿果皮多糖提取得率的影響

2.2 響應面法優化提取工藝

根據單因素試驗的結果，采用中心組合原理，將液料比(X1)、超聲波功率(X2)、提取時間(X3)、提取溫度(X4)設為自變量，多糖提取得率為因變量(Y)，進行響應面法試驗設計，試驗結果見表1。

表1 響應面分析方案及結果

續表1

表2 回歸模型方差分析

通過Design Expert 10.0.2分析，得出多糖提取工藝的最佳條件為液料比28.94 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率384.76 W、提取時間102.16 min和提取溫度62.7 ℃，提取得率高達29.50%。根據實際實驗條件調整，最佳提取條件是液料比30 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時間100 min和提取溫度60 ℃。在進行5次驗證實驗后，得到多糖提取得率平均值為(29.15±0.26)%，與理論值較為接近，說明此響應面模型可靠。

2.3 圓齒野鴉椿果皮多糖的分離純化

圖2 圓齒野鴉椿果皮多糖的洗脫曲線

將提取的多糖溶液進行醇沉后，用DEAE-52纖維素柱對其進行分離純化。采用0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9 mol/L的NaCl溶液依次進行梯度洗脫，每個濃度洗脫液體積200 mL，收集每管洗脫液5 mL，采用苯酚-硫酸比色法于490 nm波長下檢測每管洗脫液的吸光值。通過繪制洗脫液的管數與其吸光值的關系曲線，得到一個明顯的峰(見圖2)。合并此峰相應的洗脫液(40～53管)，先用旋轉蒸發儀濃縮后再透析除鹽，然后對其冷凍干燥，得到了圓齒野鴉椿果皮多糖的一個主要成分，命名為PEP。采用考馬斯亮藍染色法和苯酚-硫酸法檢測PEP中蛋白質和多糖的含量，其中蛋白質為0.02%，多糖為89.26%，糖醛酸為7.38%。采用高效GPC法測定PEP的相對分子質量，結果表明：PEP化學均一性較好，基本呈現單一峰形，重均相對分子質量(Mw)為4 958，數均相對分子質量(Mn)為3 664，Z均相對分子質量(Mz)為5 866，聚合物分散性指數(PDI)為1.353，接近1，說明PEP多糖分子質量分布比較均勻。

2.4 PEP單糖組成分析

1.甘露糖mannose； 2.核糖ribose； 3.鼠李糖rhamnose； 4.葡萄糖醛酸gluconose； 5.半乳糖醛酸galactose aldose； 6.葡萄糖glucose； 7.半乳糖galactose； 8.阿拉伯糖 arabinose； 9.木糖xylose； 10.巖藻糖fucose

PEP經過柱前衍生化，并用HPLC檢測其單糖組成情況，結果如圖3所示。PEP含有10種單糖，分別為甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、核糖。根據標準品中單糖濃度、樣品和標準品單糖峰面積的比值，計算出PEP中含甘露糖5.65%、葡萄糖37.06%、半乳糖19.51%、巖藻糖2.24%、木糖26.10%、 核糖1.33%、 葡萄糖醛酸0.89%、 鼠李糖2.33%、 半乳糖醛酸0.68% 和阿拉伯糖4.20%。分析結果表明：圓齒野鴉椿果皮多糖中的葡萄糖、木糖和半乳糖含量較高。葡萄糖和半乳糖為主要的供能糖類，而木糖為優質的無熱量甜味劑，對改善人體腸道微環境亦具有良好的功效[18]。文獻報道圓齒野鴉椿果實對痢疾等胃腸疾病有較好的療效[3-4]，可能與其多糖中的木糖含量較高有關。

2.5 PEP抗炎活性檢測

PEP對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子的分泌和細胞存活率的影響如表3所示。

表3 PEP對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應和存活率的影響

當PEP質量濃度為1、 2、 5和10 g/L時，RAW264.7細胞上清液分泌的NO和PGE2含量均顯著低于模型組的含量(P<0.05或P<0.01)，且上述兩個炎癥因子的含量隨PEP質量濃度增大而降低，說明PEP能抑制LPS誘導的RAW264.7細胞NO和PGE2炎癥因子的分泌；MTT法對給藥后的細胞進行檢測，發現PEP給藥濃度在0～10 g/L范圍內時，RAW264.7細胞的存活率變化不顯著(P>0.05)，表明PEP對RAW264.7細胞無明顯細胞毒作用。

3 結 論

3.1采用超聲波輔助提取圓齒野鴉椿果皮多糖，通過單因素法和響應面法結合，優化了多糖的提取條件。考察了不同液料比、超聲波功率、提取時間和提取溫度對多糖提取得率的影響，結果表明：優化后的提取條件為液料比30 ∶1(mL ∶g)、超聲波功率400 W、提取時間100 min、提取溫度60 ℃，響應面法優化得到的最高理論提取得率為29.50%，該條件下5次驗證試驗的平均提取得率為(29.15±0.26)%，說明此工藝多糖提取得率高且重復性較好。

3.2采用DEAE-52纖維素柱對醇沉后的多糖進行分離純化，得到一個主要組分PEP，經高效凝膠滲透色譜測得多糖的分子質量約為5 ku，柱前衍生化HPLC分析結果顯示：PEP中含有10種單糖，其中甘露糖5.65%、葡萄糖37.06%、半乳糖19.51%、巖藻糖2.24%、木糖26.10%、核糖1.33%、葡萄糖醛酸0.89%、鼠李糖2.33%、半乳糖醛酸0.68%和阿拉伯糖4.20%。

3.3采用LPS誘導巨噬細胞RAW264.7構建炎癥反應細胞模型，考察PEP給藥后對細胞存活率和炎癥因子分泌量的影響。結果顯示：1～10 g/L的PEP能降低LPS誘導的炎癥因子NO和PGE2的分泌，并呈現劑量依賴性，且對RAW264.7細胞的存活率無顯著影響，體現了圓齒野鴉椿果皮多糖具有高抗炎活性和無細胞毒性的優點，提示圓齒野鴉椿果皮多糖具有良好的開發利用前景。