基質固相分散-氣相色譜質譜聯用法測定沉香中精油的化學成分

陳虹霞， 周 昊,2， 葉建中， 陶 冉， 李文君, 王成章,2*

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；生物質化學利用國家工程實驗室;國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室；江蘇省生物質能源與材料重點實驗室；江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210042； 2.中國林業科學研究院 林業新技術研究所，北京 100091)

沉香為瑞香科沉香屬(Aquilaria)植物中含有黑色樹脂的木質部分，具有極高的藥用和收藏價值，是我國以及東南亞地區的傳統名貴藥材，通常被用作鎮靜劑。它也是名貴的天然香料，在世界范圍內被用作熏香[1]。沉香和沉香精油的研究表明，色酮、倍半萜和芳香性小分子化合物是其主要化學成分[2-3]。目前沉香精油化學成分的研究通常采用乙醚超聲波法、乙醚冷浸法、超臨界二氧化碳萃取法或水蒸氣蒸餾法提取，然后進行檢測分析。乙醚萃取法溶劑用量大，而超臨界二氧化碳萃取法和水蒸氣蒸餾法的樣品用量大且提取時間長。基質固相分散(MSPD)是Barker于1989年提出的，在樣品制備中得到了廣泛的應用，已被證明是一種簡單、高效、通用的測定固體和半固體基質中各種分析物的技術[4-6]。MSPD技術將固體樣品在介質中與分散劑混合研磨，樣品的原始結構被破壞，從而可以釋放出分析物。然后將所得混合物加載到層析柱上，用適當的溶劑洗脫分析物。在這種方法中，提取和純化過程可以集成到一個步驟中，這與其他傳統方法不同。集成不僅可以大大減少分析時間和有機溶劑的消耗，而且可以得到滿意的富集因子[7]。本研究采用MSPD法對沉香精油進行提取，以沉香化學成分為指標，對吸附基質種類和比例、分散溶劑種類和比例、洗脫溶劑用量等幾個影響因素進行優化，得到最佳的MSPD條件。建立沉香精油化學成分檢測的基質固相分散-氣相色譜質譜聯用方法，并將實驗結果與乙醚超聲波法進行比較，以期為沉香質量評價和后續的調查研究提供一種新方法。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

沉香樣品，產自海南，為生物結香方式，樣品粉碎成粉末，過0.85 mm的篩，備用。十八烷基硅膠填料(C18)、辛基硅膠填料(C8)購于大連依利特分析儀器有限公司； 硅藻土、硅膠、硅酸鎂顆粒、石英砂、甲醇、無水乙醇、正丙醇、異丙醇、正己烷、乙酸乙酯和1,4-二氧雜環己烷(二氧六環)購于國藥集團化學試劑有限公司；芐基丙酮購于阿拉丁生化科技股份有限公司；檀香醇購于上海源葉生物科技有限公司；2-(2-苯乙基)色酮購自中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所。GC2014C型氣相色譜(GC)儀，日本島津公司；Agilent-7890型氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)儀，美國Agilent Technologies有限公司。

1.2 沉香精油的提取

1.2.1基質固相分散提取及單因素試驗 稱取沉香粉末0.5 g，加入吸附基質和分散溶劑置于研缽中，用研杵使其混勻并研磨完全后，轉入到底部墊有脫脂棉的10 mL注射器中。用洗脫溶劑進行洗脫，收集洗脫液，在減壓條件下，蒸干溶劑，然后加1 mL的乙醇溶解，過0.45 μm的濾膜，得到供試樣品溶液，用GC進行峰面積的檢測。沉香精油成分復雜，根據文獻[8～10]可知，其精油成分達到45～77種，一方面化合物種類太多，另一方面相當一些化合物沒有標準物質可以采購，因此不能完全對所有成分的提取量變化進行研究。沉香精油的主要成分為芳香族化合物、倍半萜和色酮類化合物，最終從芳香族化合物中選擇芐基丙酮，倍半萜中選擇檀香醇，色酮類化合物中選擇2-(2-苯乙基)色酮作為主要分析對象，設計單因素試驗，研究不同條件對沉香精油基質固相分散提取的影響。選取了5個因素，分別為吸附基質種類、樣品與吸附基質的比例、分散溶劑種類、樣品與分散溶劑的比例和洗脫溶劑用量進行基質分散提取試驗。考察不同因素對芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮GC檢測峰面積的影響。

1.2.2乙醚超聲波提取 稱取沉香粉末0.5 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入乙醚30 mL，在室溫下，超聲波處理60 min，在減壓條件下，蒸干溶劑，然后加1 mL的乙醇溶解，過0.45 μm的濾膜，即為供試樣品溶液，用GC進行峰面積的檢測[11]。

1.3 精油中3種主要化合物的測定

1.3.1標準樣品溶液的制備 將芐基丙酮、檀香醇、2-(2-苯乙基)色酮用乙醇溶解于10 mL的容量瓶中，分別配置成1 g/L的儲備液，于4 ℃保存。

1.3.2氣相色譜分析 色譜柱為HP-5彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.32 μm)；程序升溫：初始溫度為50 ℃，3 ℃/min升至200 ℃，然后5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min，運行時間86 min。載氣為高純氨氣，流速為1.0 mL/min，不分流進樣，進樣體積1 μL，氣化室溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃。

通過對比供試樣品溶液與標準品的色譜圖，確定供試樣品溶液氣相色譜圖中芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮的出峰位置，得到對應的峰面積。

1.4 精油化學成分的GC-MS分析

氣相色譜分析條件同1.3.2節。質譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，離子源選用EI源，電子能量70 eV，光電倍增管電壓220 V，掃描范圍29～600 u，質譜庫NIST。

2 結果與討論

2.1 沉香精油基質固相分散提取的影響因素

2.1.1吸附基質類型 吸附基質的類型對MSPD提取起著關鍵作用，一方面，吸附基質在研磨過程中，可以破壞樣品的結構，使目標化合物暴露；另外一方面，可以將化合物固定在吸附基質上，然后通過溶劑提取出來[12]。固定吸附基質與樣品(沉香粉末)的質量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯(體積比9 ∶1，下同)混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g),考察7種吸附基質(C18、C8、沙子、硅藻土、硅膠、硅酸鎂和石英砂)對芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個化合物峰面積的影響，結果見表1。從表1可以看出，C8、硅藻土和硅酸鎂表現出相似的提取效果，效果較好，而沙子和石英砂的效果最差。這可能是由于沙子和石英砂的顆粒較大，比表面積較小，在吸附目標化合物時，效果不理想。C8、硅藻土和硅酸鎂具有較大的比表面積和微孔通道，對這3個化合物的吸附效果較好。C18和硅膠的提取效果欠佳，可能是由于它們與化合物之間形成了較強的氫鍵結合，使洗脫溶劑難以完全將目標化合物洗脫下來。綜合比較，由于硅酸鎂對芐基丙酮和檀香醇的吸附效果優于C8和硅藻土，因此選擇硅酸鎂作為吸附基質用于后續的實驗。

2.1.2吸附基質與樣品的比例 吸附基質與樣品的比例是影響MSPD提取過程的重要因素之一。固定硅酸鎂為吸附基質，洗脫溶劑正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察吸附基質與樣品的質量比(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1 和5 ∶1)對芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個化合物峰面積的影響。從表1可以看出，當質量比增至4 ∶1時， 3個化合物峰面積隨之增加，這是由于吸附基質與樣品的接觸面積增加，從而增強了對化合物的吸附能力。但到5 ∶1時， 3個化合物的峰面積都隨之略微下降，可能由于過多的吸附基質，使化合物的洗脫受到阻礙。因此，選擇吸附基質與樣品的質量比為4 ∶1。

2.1.3分散溶劑種類 分散溶劑的選擇是植物精油類樣品提取過程中的一個重要參數，分散溶劑既要能與樣品中的化合物相似相溶，又要能夠與洗脫溶劑混溶。固定硅酸鎂為吸附基質，吸附基質與樣品的質量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察5種分散溶劑(甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和1,4-二氧六環)對芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個化合物峰面積的影響。從表1可以看出，乙醇和異丙醇作為分散溶劑時，化合物的峰面積相對較強。在實驗操作過程中，乙醇作為分散溶劑時，樣品的萃取過程非常緩慢，需要借助真空系統才能達到。因此，綜合考慮，采用異丙醇作為分散溶劑。

2.1.4樣品與分散溶劑的比例 固定硅酸鎂為吸附基質，吸附基質與樣品質量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，考察分散溶劑與樣品的比例(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1、 5 ∶1和6 ∶1， mL ∶g)對芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個化合物峰面積的影響。從表1可以看出，隨著分散溶劑與樣品的比例從1 ∶1增加至4 ∶1， 3個化合物的峰面積隨之增加，這可能是由于正丙醇量的增加，可以加速這些化合物的溶出，促進它們在洗脫溶劑中的分散。然而，進一步將正丙醇的量增加至5 ∶1和6 ∶1時，3種化合物的峰面積反而略有下降，可能是由于過量的正丙醇使化合物與吸附基質之間形成強列的相互作用，使化合物不能夠完全解吸下來。因此，分散溶劑與樣品的比例選擇為4 ∶1(mL ∶g)。

表1 不同條件對沉香精油基質固相分散提取的影響

2.1.5洗脫溶劑用量 為了能有效地洗脫精油成分，基本都采用正己烷/乙酸乙酯體積比9 ∶1作為洗脫體系[13-14]。固定硅酸鎂為吸附基質，吸附基質與樣品質量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，分散溶劑正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察洗脫溶劑用量(2、 4、 6、 8和10 mL)對芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個化合物峰面積的影響。從表1可以看出，隨著洗脫溶劑用量的增大，3個化合物峰面積逐漸增大，到6 mL時趨于平穩，說明6 mL的正己烷/乙酸乙酯混合液作為洗脫溶劑，可以達到較好的洗脫效果。

根據以上單因素試驗結果，得到沉香精油基質固相分散提取的最佳工藝條件為：硅酸鎂為吸附基質，吸附基質與樣品質量比為4 ∶1，分散溶劑為異丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，洗脫溶劑為體積比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量6 mL。在此條件下，進行3次平行試驗，沉香精油的提取得率平均值為(9.19±0.15)%，而傳統的乙醚超聲波提取的得率為(6.65±0.22)%。

2.2 沉香精油的化學組成

2.2.1化學組成分析 基質固相分散提取和乙醚超聲波提取的沉香精油的總離子流圖見圖1，2種提取方法的色譜峰的整體差異不大。基質固相萃取的色譜峰的豐度比乙醚超聲波提取的高，這與基質固相萃取的得率大有關。各峰對應的質譜圖通過Nist17標準質譜圖系統檢索，結合質譜圖與文獻數據對照確定其化學成分，采用峰面積歸一化法確定各化合物的含量(以相對峰面積計)，結果見表2。

a.基質固相分散提取matrix solid-phase dispersion; b.乙醚超聲波提取ultrasonic assisted ether extraction

表2 不同提取方法所得沉香精油的化學成分

2種提取方法共鑒定出54種主要成分，其中基質固相分散提取和乙醚超聲波提取分別鑒定出48和41種。基質固相分散提取的沉香精油中已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜類占25.67%，色酮類占26.85%，脂肪族占7.50%；乙醚超聲波提取的沉香精油中已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的77.90%，其中芳香族占3.68%，倍半萜類占25.78%，色酮類占32.83%，脂肪族占11.38%。

2.2.2兩種提取方法對比 基質固相分散提取檢測出的總化合物的數量略高于乙醚超聲波提取，增加的成分主要為倍半萜類化合物，如γ-芹子烯、β-檀香醇、纈草- 4,7(11)二烯、α-愈創木烯、白菖醇和1,9-馬兜鈴二烯。芹子烯具有泥土或根部的氣味；β-檀香醇呈現典型的檀香木香氣，帶有濃烈的木香和奶香，以及略帶尿的氣味[15]，這些化合物的存在賦予沉香精油更豐富的香氣組成。但2種方法得到的倍半萜類化合物的總含量沒有明顯區別。在基質固相分散提取得到的沉香精油中，相對分子質量(Mr)小的成分較多，而乙醚超聲波提取得到的沉香精油中，Mr大的成分較多。基質固相分散提取沉香精油中色酮類和脂肪族化合物總含量較乙醚超聲波提取的精油略低。這可能是由于乙醚超聲波提取的主要溶劑乙醚的極性較低，同時鑒于超聲波的存在，產生了空化、機械和熱效應，可以有效破壞沉香的細胞壁，加速乙醚滲透到沉香細胞中，使得色酮類和脂肪族這些Mr大的化合物能更好地傳質和溶出[16-17]。

色酮類化合物是沉香及沉香精油的主要活性成分，也是品質評價的一個重要指標。色酮類化合物在加熱裂解時，會產生苯甲醛和對甲氧基苯甲醛，可以產生持久的香味[18]，同時具有多種生物及藥理活性，如神經保護[19]、抗腫瘤細胞毒[20]、抑制酶活性[21]、抗菌[22]和抗炎[23]等。沉香中色酮類化合物主要分為4種類型：四氫-2-(2-苯乙基)色酮、環氧四氫-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮和二環氧-2-(2-苯乙基)色酮[24]。采用氣相色譜-質譜法從基質固相分散提取和乙醚超聲波提取的沉香精油共檢測出4種色酮化合物，分別為2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-苯乙基色酮、6,7-二甲氧基-2-(苯基乙基)色酮和6,7-二甲氧基-2-[2 -(4′-甲氧基苯基)乙基]色酮。兩種提取方式在色酮類化合物的種類上沒有區別，但是乙醚超聲波提取的色酮類化合物含量較基質固相分散提取的高。從色酮類含量來看，乙醚超聲波提取較優。脂肪族化合物在受到微生物、光、熱和空氣的作用下，容易氧化形成過氧化物，再分解生成低Mr的酸[25]。從表2的分析來看，乙醚超聲波提取的脂肪族化合物的含量較基質固相分散提取的高。而沉香精油中的脂肪族化合物不是越多越好，脂肪族化合物含量較多時，長時間的儲存容易使沉香精油發生酸敗，產生特殊有刺激性的氣味，從而影響沉香精油的品質。因此，從一這方面考慮，基質固相分散提取較優。從精油的化學組成上來看，兩種提取方法在主要成分上較一致，主要為芳香族、倍半萜類、色酮類和脂肪族化合物。相比乙醚超聲波提取，基質固相分散提取的沉香精油中倍半萜化合物的組成更為豐富。但是乙醚超聲波提取的沉香精油中色酮類化合物和脂肪族化合物的含量較高。因此也很難確定兩種提取方法哪個更優。從提取過程和得率上來看，基質固相分散提取具有以下優點：1) 提取得率較高；2) 提取過程有機溶劑的用量少，僅為乙醚超聲提取的五分之一； 3) 提取過程常溫就可以進行，且提取過程對化學成分的破壞小。因此，綜上所述，基質固相分散提取結合氣相色譜-質譜法能夠真實反映沉香精油的化學成分，可作為沉香品質評價的一種快速鑒別方法。

3 結 論

3.1建立了基質固相分散提取沉香精油的方法，通過單因素試驗確定了最佳工藝條件：硅酸鎂為吸附基質，吸附基質與樣品質量比為4 ∶1，分散溶劑為異丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，洗脫溶劑為體積比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量6 mL。在此條件下，沉香精油的提取得率為(9.19±0.15)%。

3.2采用GC-MS分析了基質固相分散提取沉香精油的化學成分，總共鑒定化合物48種，已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜類占25.67%，色酮類占26.85%，脂肪族占7.5%，沉香精油化學成分組成與乙醚超聲波提取得到的相似。

3.3基質固相分散提取具有提取得率高，溶劑消耗少等優點，進一步結合氣相色譜-質譜法能夠真實反映沉香精油的化學成分，可作為沉香品質評價的一種快速鑒別方法。