開口箭根狀莖提取物對椪柑貯藏品質(zhì)的影響

姚姝鳳, 許嘉琍, 高 宏, 汪春學(xué), 張海波, 商士斌*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室,江蘇 南京 210042;2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037;3.長春市生態(tài)環(huán)境保護研究所,吉林 長春 130041)

柑橘類水果在世界上廣泛種植且產(chǎn)量豐富[1]，其口感多汁，富含維生素，營養(yǎng)價值高，深受消費者青睞。然而，柑橘采后會由于蒸騰作用失去水分，同時由于呼吸作用等代謝活動消耗有機物，還會受到微生物的侵染而腐爛，失去商業(yè)和食用價值[2]。涂膜保鮮是柑橘采后貯藏常用的保鮮方法[3]。生物質(zhì)涂膜保鮮劑覆蓋在果品表面，能形成薄膜，可抑制水分蒸發(fā)，調(diào)節(jié)呼吸作用，具有無毒、來源廣泛的優(yōu)點[4]。被膜劑和抑菌劑是涂膜保鮮劑中兩個重要組分。松香樹脂具有易成膜，價格便宜等特點，且對柑橘、草莓等采后水果具有良好的保鮮效果[5-6]，可用作被膜劑。抑菌劑能有效抑制真菌侵染而產(chǎn)生的采后病害，是涂膜保鮮劑中的另一個重要的組分。柑橘采后易受真菌如指狀青霉(Penicilliumdigitatum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、白地霉(Geotrichumcandidum)等侵染，分別產(chǎn)生綠霉病、青霉病和酸腐病，且在貨架期內(nèi)黑曲霉(Aspergillusniger)和匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)也會引起柑橘腐爛[7-9]。控制真菌病害、延緩腐爛速率，能有效提高柑橘的商業(yè)價值、延長貨架期。目前，使用化學(xué)抑菌劑對柑橘進行防腐處理是應(yīng)用最為廣泛的防腐方法[10]。傳統(tǒng)的人工合成的化學(xué)抑菌劑易殘留、不易降解且成分單一，長期使用易使真菌對其產(chǎn)生抗藥性，大量使用會對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成一定的威脅，如多菌靈在我國使用廣泛，但其殘留可能引起肝病和染色體畸變，對哺乳動物有害[11]。生物質(zhì)抑菌劑，由于具有毒性小、對人和動物等非靶標(biāo)生物危害小、環(huán)境友好等特點，因此能成為化學(xué)抑菌劑的良好替代品，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[12-14]。當(dāng)前對天然產(chǎn)物中的抑制水果致腐真菌的活性成分的研究主要為精油類[15-16]，但精油類價格昂貴、其氣味影響水果風(fēng)味等問題限制了其在水果保鮮上的應(yīng)用[17]。開口箭(TupistrachinensisBaker)是我國民間藥用植物，其提取物對荔枝霜疫霉菌及香蕉炭疽病菌等具有一定的抑制作用[18-19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，開口箭根狀莖提取物對指狀青霉等多種霉菌具有抑制作用[20]，且從開口箭中分離得到的甾體皂苷具有良好的抑制指狀青霉和匍枝根霉活性[21]。因此，本研究將開品箭根狀莖提取物作為抑菌劑，以松香樹脂(RAE)為被膜劑[5]，用于椪柑涂膜保鮮，考察了開口箭根狀莖提取物對椪柑外觀品質(zhì)、生理生化指標(biāo)及防御性酶活性的影響，以期為天然防腐保鮮劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

開口箭根狀莖購自湖北神農(nóng)架中藥店，經(jīng)吉首大學(xué)董愛文教授鑒定為TupistrachinensisBaker，標(biāo)本(No.JIU04988)存于吉首大學(xué)植物標(biāo)本館。開口箭根狀莖于50 ℃下烘干、粉碎待用。松香樹脂(RAE)，以精制松香為原料，先與馬來酸酐加成，引入親水基團(—COOH)，再與戊四醇催化酯化反應(yīng)得到水溶性松香樹脂[5]。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，北京三藥科技發(fā)展有限公司。氫氧化鉀、油酸等，均為市售分析純。

指狀青霉(Penicilliumdigitatum)ACCC 30389、黑曲霉(Aspergillusniger)ACCC 30005、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)ACCC 36973真菌菌株，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

椪柑，2018年12月7日采于江蘇省蘇州市東山鎮(zhèn)的一個當(dāng)?shù)毓麍@，成熟度八至九成。椪柑采后盡快運到實驗室，挑選出大小、形狀和果皮顏色大致相同，且無病蟲害及機械損傷的柑橘。

TMS-PR質(zhì)構(gòu)儀，美國食品技術(shù)公司；PAL-1數(shù)字糖度計，日本ATAGO公司；TU1900紫外-可見分光光度計，中國北京浦肯野儀器有限公司；TGL-16M冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific公司。

1.2 提取物的制備及抑菌性能測定

1.2.1制備 取開口箭根狀莖粉末500 g，用95%乙醇浸泡過夜，液料比10 ∶1(mL ∶g)，60 ℃下提取3 h，重復(fù)提取3次，合并濾液，50～60 ℃減壓濃縮得到浸膏。浸膏加適量的水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取有機相與水相體積比約1 ∶1。所得石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取液分別于50～60 ℃減壓濃縮得到浸膏，并于35～40 ℃下真空干燥至干，得石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)、正丁醇提取物(C)。

1.2.2抑制真菌活性 抑制真菌活性測定參考Matsuzaki等[22]和Wilson等[23]的方法。采用2倍連續(xù)微量稀釋法，將96孔無菌酶標(biāo)板中1～10列提取物最終質(zhì)量濃度設(shè)定為2 500、 1 250、 625、 312.5、 156.25、 78.13、 39.06、 19.53、 9.77、 4.88 mg/L，真菌孢子懸浮液濃度為1×105個/mL，每孔總體積為200 μL。設(shè)置陰性對照，即溶劑對照，只含對應(yīng)濃度的溶劑，不含提取物；陽性對照，提取物替換為等濃度的山梨酸鉀和苯甲酸鈉，用無菌蓋覆蓋微孔板并在(28±1) ℃的黑暗中培養(yǎng)72 h。在實驗開始時和結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在600 nm處測定每個孔的光密度(OD600)。所有實驗設(shè)定3個平行實驗，重復(fù)2次，計算抑制率，計算公式如下：R=[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]×100%，其中ΔA0為陰性對照光密度增量，即陰性對照組72 h的光密度和0 h時光密度差值；ΔAt為實驗組或陽性對照組的光密度增量。半數(shù)抑制濃度(IC50)值采用GraphPad Prism 8計算。

1.3 保鮮劑的制備及椪柑處理

將RAE溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%氫氧化鉀水溶液中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的RAE被膜劑。分別取A、B、C，加少量乙醇溶解后，加入到RAE被膜劑中，配成提取物質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，再分別滴加油酸調(diào)節(jié)pH值至7～8，制成保鮮劑AR、BR、CR，備用。柑橘清洗后，在室溫下風(fēng)干表面水分，隨機分為5組：空白對照組，不涂膜，用清水處理；陰性對照組，用海綿擦在椪柑上均勻涂抹不加抑菌劑的RAE被膜劑；實驗組1～3，分別用海綿擦在椪柑上均勻涂抹保鮮劑AR、BR和CR。處理后的椪柑，在室溫下風(fēng)干表面水分。所有椪柑在室溫下貯藏36天，每6天取樣一次，進行椪柑外觀觀察并測定其相關(guān)生理生化指標(biāo)。

1.4 保鮮指標(biāo)測定

1.4.1腐爛指數(shù) 腐爛指數(shù)參考Cao等[24]的方法計算。按椪柑腐爛程度，將其分為5個等級，其中0=無腐爛； 1=輕微感染，腐爛面積小于果表面積的1/8； 2=輕微腐爛，腐爛面積大于果表面積的1/8但小于1/4； 3=中度腐爛，腐爛面積大于果表面積的1/4但小于1/2； 4=嚴(yán)重腐爛，腐爛面積大于果表面積的1/2但小于果面的2/3； 5=全腐爛，腐爛面積大于果表面積的2/3。腐爛指數(shù)的計算公式如下：∑(i×Ni)/(imax×n)，其中i表示腐爛級別，Ni表示相應(yīng)腐爛級別(i)的果實數(shù)，imax代表最高腐爛級別，n代表測量的果實總個數(shù)。

1.4.2失重率 稱取貯藏前果實和貯藏后果實的質(zhì)量，并按以下公式計算失重率：失重率=(貯藏前質(zhì)量-貯藏后質(zhì)量)/貯藏前質(zhì)量×100%。

1.4.3果肉硬度 使用質(zhì)構(gòu)儀，用穿刺法測定果肉硬度。每組隨機取5～6個果實，在每個果實兩側(cè)赤道區(qū)去果皮，測定其果肉硬度。穿刺試驗使用3.5 mm圓柱探頭，穿刺深度為10 mm，直接在儀器上讀取硬度值，每個果實測定3個點，計算平均值，單位為N。

1.4.4可溶性固形物含量 椪柑果汁中可溶性固形物含量用數(shù)字糖度計測定。測定硬度后的果實，剝?nèi)ス?，用檸檬夾榨汁器擠出果汁，滴于數(shù)字糖度計測試槽，測量并記錄結(jié)果，每組取5個果實進行測定，計算平均值。

1.4.5維生素C含量 維生素C含量用2，6-二氯靛酚滴定法測定[25]，維生素C的濃度根據(jù)2，6-二氯靛酚的消耗量計算。

1.4.6丙二醛含量 丙二醛含量參考文獻[26]報道的方法測定。

1.4.7過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性 參考文獻[27～29]中的測定方法，測定并計算椪柑果肉中過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 開口箭根狀莖提取物抑制真菌活性

開口箭根狀莖石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)和正丁醇提取物(C)對3種致腐真菌的抑制活性如表1所示。其中，B對指狀青霉、黑曲霉和匍枝根霉的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.190、 0.262和0.238 g/L，小于其他2種提取物，抑制活性最強；其次為A，C的抑制真菌活性最弱。與陽性對照相比，B對指狀青霉的抑制活性與苯甲酸鈉和山梨酸鉀的相差不大，對黑曲霉和匍枝根霉的抑制活性高于陽性對照苯甲酸鈉，但略低于山梨酸鉀。

表1 開口箭根狀莖提取物抑制真菌活性

2.2 開口箭根狀莖提取物對椪柑貯藏品質(zhì)的影響

2.2.1腐爛指數(shù) 腐爛是影響水果貯藏品質(zhì)、造成經(jīng)濟損失的最重要因素。降低腐爛速率對于保持水果品質(zhì)，延長貨架期尤為重要。不同處理方式的椪柑腐爛指數(shù)如圖1(a)所示，隨著儲藏時間的增加，5組椪柑的腐爛指數(shù)均不斷上升。在貯藏18天左右，空白對照和陰性對照組(RAE)腐爛指數(shù)迅速增加，而添加AR和BR的處理組上升趨勢不明顯，說明AR或BR能有效降低椪柑的腐爛率。添加CR的處理組腐爛指數(shù)在前期與空白對照及陰性對照相比較低，而后期(24天后)防腐效果較差。表明，在RAE中添加A或B能有效降低椪柑腐爛率，椪柑儲藏36天后，腐爛指數(shù)分別為10.6%和7.2%，分別較空白對照(16.7%)降低6.1和9.5個百分點?？梢?，添加AR或BR的保鮮劑具有良好的防腐活性。

2.2.2失重率 水果采后會因蒸騰作用失水，且呼吸作用等新陳代謝會消耗有機物[30]，使總質(zhì)量減輕，即失重率相應(yīng)升高。因此，失重率是評價水果新鮮度的另一個重要指標(biāo)。不同處理方式的椪柑失重率隨貯藏時間的變化如圖1(b)所示，在RAE中添加A或B進行處理的AR和BR組的失重率明顯低于空白對照組，略低于陰性對照組。而RAE中添加C的CR組與空白對照組相比失重率降低，但與陰性對照組相比，差異不明顯?？傮w來看，RAE在防止果皮水分蒸發(fā)方面起到關(guān)鍵作用，而在其中添加A或B，其失重率與空白對照組相比降低更加顯著。這是由于微生物侵染水果后，會消耗水果本身的有機物，添加A或B作為抑菌劑后，椪柑在貯藏后期受微生物作用影響小，這部分失重不顯著。

圖1 開口箭根狀莖提取物對椪柑腐爛指數(shù)(a)、失重率(b)和果肉硬度(c)的影響

2.2.3果肉硬度 椪柑在貯藏初期由于細(xì)胞壁物質(zhì)的分解作用，果肉細(xì)胞離散，組織變軟，硬度逐漸下降[31]。而貯藏30天后，柑橘大量失水，柑橘果實變干、化渣性差，逐漸出現(xiàn)輕微枯水癥狀[32]，硬度上升。這種現(xiàn)象在枇杷貯藏過程中也會出現(xiàn)[33]。由圖1(c)可以看出，在貯藏18天中，添加AR、BR和CR的處理組，硬度稍高于空白對照組但與陰性對照組差別不大，說明其果肉飽滿度較高，新鮮度強，且可能RAE起到主要的保鮮作用。而貯藏30天后，空白對照組的硬度迅速上升，RAE中添加A、B或C的處理組硬度上升較慢，且略低于陰性對照組。說明添加開口箭根狀莖提取物后，對于保持椪柑新鮮度起到一定的作用，能夠延緩“枯水癥”發(fā)生。

2.2.4可溶性固形物含量 可溶性固形物(主要為可溶性糖)含量是反映果品成熟度和品質(zhì)狀況的指標(biāo)[28]。果品在成熟過程中，可溶性固形物含量逐漸增加。由圖2(a)可以看出，所有椪柑可溶性固形物含量在36天貯藏期間變化不明顯，基本為10%～12%，可能由于椪柑成熟度較高，因此可溶性固形物含量變化不大，且添加開口箭根狀莖提取物對柑橘貯藏期間可溶性固形物含量幾乎無影響。

2.2.5丙二醛含量 丙二醛(MDA)是生物膜脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，MDA的積累可能對生物膜和細(xì)胞造成一定的傷害[34]，因此可通過測定MDA含量了解膜脂過氧化程度，以間接測定生物膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。從圖2(b)中可以看出，在儲存36天期間，丙二醛含量基本呈上升的趨勢。在貯藏30天后，空白對照組的丙二醛含量上升非常顯著，而處理組上升趨勢相對緩慢。說明添加開口箭根狀莖提取物A、B、C能在儲藏后期延緩丙二醛含量上升，有助于保持水果的新鮮度。

2.2.6維生素C含量 維生素C是柑橘類水果的重要營養(yǎng)成分。由圖2(c)可以看出，隨著貯藏時間的延長，維生素C的含量基本呈現(xiàn)下降趨勢，在貯藏18天內(nèi)下降較快，后期下降速度較慢。添加C的保鮮劑處理組的椪柑在前期保持較高的維生素C含量，而后期下降速度加快。而添加AR或BR保鮮劑處理的椪柑中維生素C含量下降較慢，在貯藏36天后，平均量保持在0.024%左右。

圖3 開口箭根狀莖提取物對椪柑過氧化氫酶(a)、過氧化物酶(b)和超氧化物歧化酶(c)活性的影響

綜上所述，添加BR保鮮劑使椪柑果實的抗氧化酶活性峰值延后，在貯藏后期，抗氧化酶活性保持較高的水平，說明以BR處理椪柑能延緩椪柑果實衰老，使果實保持對外界環(huán)境的抗性。

3 結(jié) 論

3.1考察了開口箭根狀莖的石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)和正丁醇提取物對3種真菌：指狀青霉、黑曲霉和匍枝根霉的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，開口箭提取物對3種真菌都具有一定的抑制作用，其中，B對3種真菌抑制活性最強。

3.2以松香樹脂為被膜劑，A、B、C為抑菌劑，制成了保鮮劑AR、BR和CR，考察了添加開口箭根狀莖提取物的松香基保鮮劑對椪柑的防腐保鮮效果。研究發(fā)現(xiàn)，添加AR和BR保鮮劑能有效降低椪柑的腐爛率、延緩丙二醛含量的升高以及維生素C含量的降低，且添加BR能提高果實抗氧化酶的活性，而在失重率和果肉硬度方面，RAE起到主要保鮮作用，所有涂膜組對可溶性固形物含量幾乎無影響?？梢姡荒┲刑砑覤對椪柑具有良好的防腐保鮮作用，有望在柑橘涂膜保鮮劑中加以應(yīng)用。