不同生長時間對美國皂莢殼皂苷的影響比較研究

徐 偉， 肖志強(qiáng)， 李純懿， 蔣建新， 朱莉偉

(北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家林業(yè)和草原局木本香料(華東)工程研究中心，北京100083)

美國皂莢是一種雌雄異株的木本植物，屬于豆科皂莢屬，通常在五月底或六月初開花，并于冬季成熟[1],莢果呈月牙形，長度大約為15～20 cm。皂莢果殼中富含皂苷，美國皂莢殼皂苷由疏水性的皂苷元和親水性的糖鏈組成，其中糖鏈主要由4種單糖組成，分別是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖[2],皂苷的兩親性結(jié)構(gòu)決定了皂苷具有較強(qiáng)的表面活性[3]。目前美國皂莢殼皂苷沒有得到充分的開發(fā)與利用，雖然國內(nèi)對美國皂莢殼皂苷的提取工藝研究報道較多[4-7]，但鮮見關(guān)于不同生長時間美國皂莢殼皂苷上糖基及表面活性的比較研究。因此本研究以不同采摘時間的美國皂莢果殼為原料，對其進(jìn)行組分分析，對抽提得到的美國皂莢殼皂苷進(jìn)行皂苷糖基測定，并對皂苷的表面活性進(jìn)行評價和分析，旨在為美國皂莢殼皂苷資源的開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑和儀器

美國皂莢(GleditsiatriacanthosL.)采摘于北京市海淀區(qū)北京林業(yè)大學(xué)(2019年)，采摘時間為其開花后的第15、 17、 19、 21、 23和25周。樣品經(jīng)過手工剝離得到皂莢殼，將皂莢殼置于50 ℃烘箱，烘干至恒定質(zhì)量，然后經(jīng)粉碎和過篩，選取粒徑≤0.250 mm的部分，存于干燥器內(nèi)備用。石油醚、丙酮、無水乙醇、濃硫酸、香草醛均為分析純，北京化工試劑廠；L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖均為標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；AB-8型大孔吸附樹脂，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

Waters e2695型高效液相色譜儀，配備A minex HPX-87H柱和示差折光檢測器，美國Waters公司；UV- 6100A紫外可見分光光度計，上海比朗儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)、SX型箱式電阻爐控制箱，天津泰斯特儀器有限公司；R203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；BSA2245-CW型電子分析天平；BZY-101型自動表面張力儀，上海方瑞有限公司；YSQ-LS型全自動滅菌鍋，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 美國皂莢殼組分分析

1.2.1皂莢殼脂肪含量測定 稱取不同生長時間的皂莢殼粉末30.0 g(絕干質(zhì)量)并按照料液比1 ∶10(g ∶mL)加入石油醚(沸程60～90 ℃)，索式抽提8 h，將抽提液旋蒸濃縮并置于105 ℃烘箱，烘干至恒定質(zhì)量，即為脂肪的質(zhì)量。皂莢殼中脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(y,%)根據(jù)下式進(jìn)行計算：

y=m1/m×100%

(1)

式中:m1—脂肪的質(zhì)量，g；m—原料的絕干質(zhì)量，g。

1.2.2美國皂莢殼化學(xué)組成分析 根據(jù)美國再生能源實驗室(NREL/TP-510- 42618)測定脫脂和脫皂苷后美國皂莢殼中灰分和三大素(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)的組成[8]。

1.3 美國皂莢殼皂苷提取、單糖組成分析及含量測定

1.3.1美國皂莢殼皂苷的提取及純化 按照料液比1 ∶10(g ∶mL)向經(jīng)1.2.1節(jié)脫脂后的美國皂莢殼粉末中加入無水乙醇，索式抽提8 h后，將抽提液濃縮，真空干燥并研磨成粉末，得到美國皂莢殼粗皂苷。將各組美國粗皂苷溶于5倍體積的乙醇中，然后加入2倍體積的丙酮進(jìn)行沉淀，重復(fù)以上操作2次。將沉淀后的皂苷配置成30 g/L的粗皂苷水溶液并上樣至大孔吸附樹脂柱(AB-8大孔吸附樹脂)上，流速為1 mL/min[9]。吸附完成后，先用去離子水洗滌至無游離糖的存在，再分別用30%、 60%和90%的乙醇進(jìn)行洗脫(30%和60%乙醇洗脫液中未檢測到皂苷)，得到90%乙醇洗脫的皂苷樣品，對洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，得到純化的美國皂莢殼皂苷樣品。

1.3.2美國皂莢殼皂苷單糖組成分析 每組稱取適量不同生長時間的粗皂苷置于具塞耐壓瓶中，加入2.5 mL的1 mol/L鹽酸，于100 ℃水解1 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，離心取上清液，進(jìn)行高效液相色譜檢測，測定皂苷糖鏈上的單糖組成[5]。對脫皂苷后剩余固體殘渣進(jìn)行干燥。向干燥后的固體殘渣中加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%的硫酸，并在30 ℃水浴搖床中水解1 h，然后加入適量的去離子水，121 ℃繼續(xù)水解1 h[8]。將水解液用0.22 μm濾膜過濾，用高效液相色譜儀進(jìn)行單糖組成分析。高效液相色譜檢測條件為：流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min。使用L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3.3皂苷的最大吸收波長確定 稱取一定質(zhì)量的純化皂苷樣品，配置成1 g/L的皂苷標(biāo)準(zhǔn)液。吸取0.5 mL的皂苷標(biāo)準(zhǔn)液，依次加入0.5 mL 8%的香草醛溶液和4 mL 77%硫酸溶液，振蕩搖勻，在60 ℃水浴中加熱15 min，然后置于冰水浴中冷卻10 min，在紫外分光光度計下進(jìn)行200～800 nm的全波長掃描。由掃描結(jié)果可知，在545 nm處出現(xiàn)單峰且吸光度較高，因此選擇545 nm作為美國皂莢殼皂苷的最大吸收波長。

1.3.4皂苷含量的測定 分別取0.1、 0.2、 0.3、 0.4和0.5 mL皂苷標(biāo)準(zhǔn)液，置于10 mL的具塞試管并加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，按照1.3.3節(jié)中方法加入香草醛-濃硫酸顯色劑，在最大吸收波長545 nm下測定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，純化皂苷質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程：Y=2.192 4X+0.040 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，在0.1～0.5 g/L的范圍內(nèi)，純化的皂苷樣品質(zhì)量濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系，因此可以為不同生長時間的美國皂莢殼皂苷的定量測定提供依據(jù)。

取1.3.1節(jié)中6個采摘時間的美國皂莢殼粗皂苷，按1.3.4節(jié)方法測定其在545 nm下吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算皂苷的質(zhì)量濃度。根據(jù)下式計算皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(y,%):

y=cV/m×100%

(2)

式中:c—粗皂苷水溶液中皂苷的質(zhì)量濃度，g/L；V—粗皂苷水溶液的體積，L；m—原料的絕干質(zhì)量，g。

1.4 皂苷表征

1.4.1紅外光譜分析 采用Bruker-ALPHA 傅里葉變換紅外光譜儀，將開花后21周的美國皂莢殼皂苷和90%乙醇純化的美國皂莢殼2種樣品在105 ℃烘干后，與 KBr 按照質(zhì)量比1 ∶100進(jìn)行壓片，在波數(shù)為 400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.4.2表面張力測定 為了測定不同生長時間美國皂莢殼皂苷的表面活性，對6個組的美國皂莢殼皂苷進(jìn)行表面張力測定，來確定其臨界膠束濃度(CMC)。一般來說皂苷的CMC越低，則表面活性越好，更適合應(yīng)用于制作表面活性劑。從6個組中分別取適量的粗皂苷，配置成一系列質(zhì)量濃度梯度的粗皂苷水溶液(0.009～1.0 g/L)，在30 ℃下采用吊片法和自動表面張力儀測定各質(zhì)量濃度樣品的表面張力[10]。隨后以溶液質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，表面張力為縱坐標(biāo)繪制曲線，從曲線中判斷表面張力不再有明顯下降時所對應(yīng)的最低濃度為CMC值。

2 結(jié)果與討論

2.1 美國皂莢殼的組分分析

通過對美國皂莢殼的組分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)纖維素、半纖維素、皂苷和木質(zhì)素各組分含量變化，結(jié)果見表1。

表1 美國皂莢殼的組分分析

其中含量最多的是纖維素，其次是皂苷和木質(zhì)素。李瑩橋[11]也發(fā)現(xiàn)皂莢殼中含量最多的是纖維素，其次為皂苷。隨著美國皂莢的不斷生長和成熟，莢果殼的顏色逐漸加深，皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)從11.17%(15周)逐漸增加到14.21%(25周)，說明皂苷的形成是逐漸合成和積累的過程[12]。不同生長時間的美國皂莢殼中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于1%，其中開花后19周皂苷的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為1.39%。李瑩橋[11]對山皂莢(GleditsiajaponicaMiq.)果殼的化學(xué)組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)山皂莢殼中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.30%，高于美國皂莢殼的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)。不同生長時間皂莢的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2.90%～3.83%，與文獻(xiàn)報道的基本一致[13]。綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化隨著生長時間不是很明顯，最大值出現(xiàn)在19周為36.75%。

2.2 不同采摘時間皂苷上的單糖含量變化

皂苷主要是糖的半縮醛羥基與皂苷元結(jié)合的化合物[14-15]。皂苷經(jīng)過酸水解生成皂苷元和各種單糖，皂苷元以不溶于水的沉淀的形式存在，而各種單糖主要存在于水解液中。從圖1美國皂莢殼皂苷上單糖的高效液相色譜圖中可以看出，保留時間11.42、 12.32、 12.89和13.33 min對應(yīng)的色譜峰分別是葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。美國皂莢殼皂苷上糖鏈經(jīng)過鹽酸水解后，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖各峰分離效果良好，可以達(dá)到基線分離。圖2為皂苷中各單糖及總糖的含量分析，由圖可知木糖、葡萄糖和阿拉伯糖是皂苷糖鏈上主要的單糖，而鼠李糖的含量相對較少。

圖2 不同生長時間美國皂莢殼皂苷上單糖及總糖含量變化

Yu等[16]也發(fā)現(xiàn)皂莢皂苷糖鏈上單糖主要有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖。隨著美國皂莢的生長和成熟，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖得率都先降低后增加，在開花后的21周達(dá)到最小值，總糖得率的趨勢與單糖得率的趨勢一致。葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖得率波動趨勢不大，而木糖得率波動最大，由15周時的 9.97%降至21周的1.43%。皂苷上糖含量的變化可能是與皂莢內(nèi)養(yǎng)分和能量的分配方式有關(guān)，因此測定了15周至25周皂莢胚乳中半乳甘露聚糖含量的變化，結(jié)果如表2所示。從15周到21周皂莢胚乳內(nèi)甘露聚糖和半乳甘露聚糖含量逐漸增加，這可能是由于在皂莢生長過程中，皂莢內(nèi)養(yǎng)分和能量主要用于甘露糖基轉(zhuǎn)移酶合成甘露聚糖，增加了甘露聚糖含量[17-18]，使得供給美國皂莢皮皂苷上糖基合成的能量和養(yǎng)分有所降低，因此，在此期間美國皂莢殼皂苷上單糖含量逐漸降低。在21周以后胚乳內(nèi)半乳甘露聚糖合成結(jié)束，含量不再增加，此時莢果中的養(yǎng)分和能量主要用于美國皂莢殼皂苷上糖基的合成，從而使21周后皂苷上單糖含量不斷增加。

表2 不同生長時間美國皂莢胚乳中半乳甘露聚糖含量的變化

2.3 皂苷表征

圖3 美國皂莢殼皂苷的紅外光譜圖(開花后21周)

2.3.2不同成熟期美國皂莢殼皂苷表面活性的測定 30 ℃下不同采摘時間的美國皂莢殼皂苷表面張力隨濃度的變化規(guī)律如圖4所示。

隨著美國皂莢殼皂苷質(zhì)量濃度逐漸增加，皂苷的表面張力逐漸降低，21周皂莢殼皂苷溶液質(zhì)量濃度從0.009 g/L升高至1 g/L,表面張力從57.60 mN/m降低至44.57 mN/m，達(dá)到最低值。進(jìn)一步增加皂苷質(zhì)量濃度，美國皂莢殼皂苷在溶液表面已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，表面張力不再降低，此時的濃度稱為臨界膠束濃度(CMC)。CMC值愈小，皂苷在溶液中形成膠束所需的濃度愈低，使溶液表面張力降低到最低值所需的濃度愈低，即表面活性愈高[19]。此外，表面活性的高低也與皂苷兩親性結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。15～21周采摘的美國皂莢莢果內(nèi)養(yǎng)分和能量可能主要用于合成胚乳內(nèi)半乳甘露聚糖使得合成美國皂莢殼皂苷上單糖的養(yǎng)分和能量減少，從而使皂苷的親水性糖基含量降低，進(jìn)而會使皂苷的疏水性增加，CMC降低，皂苷的表面活性增加[20]。表3總結(jié)了不同生長時間皂苷的最低表面張力和臨界膠束濃度值，從表中可以看出，15到21周采摘的皂莢中皂苷的臨界膠束濃度值逐漸降低，在21周達(dá)到最低值(臨界膠束濃度為0.07 g/L)，說明在此期間皂苷的表面活性隨著生長時間的增加而逐漸增大。這可能是由于從15周到21周皂苷上親水性單糖含量(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖)逐漸降低，皂苷分子容易克服水分子的吸引力，疏水作用增強(qiáng)，表面活性增加，因此21周采摘的美國皂莢殼皂苷的表面活性最佳(臨界膠束濃度為0.07 g/L)。而23～25周采摘的美國皂莢皂苷的臨界膠束濃度值逐漸增加，可能是由于皂苷上親水的單糖含量逐漸增加，使皂苷的親水性增加，皂苷分子不容易克服水分子的吸引力，從而使表面活性降低。與商業(yè)上茶皂苷的臨界膠束濃度(1.5 g/L)相比，美國皂莢殼皂苷的臨界膠束濃度(0.07～0.50 g/L)更低，說明美國皂莢殼皂苷具有更加良好的表面活性，能有效降低水的表面張力。研究發(fā)現(xiàn)，高表面活性的皂莢皂苷能夠增強(qiáng)酶水解效率，有利于糠醛和乙酸的轉(zhuǎn)化，有利于木質(zhì)纖維原料的高值化利用[21-22]。

表3 美國皂莢殼皂苷不同采摘時間下CMC 和γCMC

3 結(jié) 論

3.1對不同采摘時間下得到的美國皂莢殼進(jìn)行提取得到粗皂苷樣品，然后經(jīng)90%乙醇洗脫得到純化皂苷樣品。對皂莢殼的組分分析發(fā)現(xiàn)美國皂莢殼皂苷的含量隨生長時間的增加而逐漸增加，說明在皂莢殼中，皂苷的形成是逐漸合成和積累的過程。

3.2對不同生長時間皂苷上的糖基進(jìn)行酸水解和高效液相色譜分析，結(jié)果表明：美國皂莢殼皂苷上糖基主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖組成，其中木糖、葡萄糖和阿拉伯糖含量較高，而鼠李糖的含量相對較少?？偺呛蛦翁呛侩S生長時間的延長呈先降低后升高趨勢，在開花后第21周糖含量到達(dá)最低值。

3.3紅外光譜結(jié)果證實了粗皂苷樣品和純化后的皂苷樣品均具有皂苷的基本紅外特征峰。不同生長時間的美國皂莢殼皂苷的表面活性評價表明，隨著生長時間的增加臨界膠束濃度逐漸降低，在開花第21周達(dá)到最低值(0.07 g/L)，此時最低表面張力為44.57 mN/m。在美國皂莢的生長和成熟過程中，隨著皂苷上糖基含量降低，疏水性增強(qiáng)，臨界膠束濃度降低，21周采摘的皂莢殼皂苷的單糖含量最低，且表現(xiàn)出最佳的表面活性。