維生素D受體在食管鱗癌中的表達及其與預后的關系

孔金玉，王 健，劉怡文，孫 蔚，原 翔，高社干

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在中國90%以上為鱗狀細胞癌[1-2]，而目前的預防及治療手段欠佳，多數患者仍不能得到有效控制，5 a生存率很低[3]。維生素D(vitamin D，VD)是一種與人體健康密切相關的脂溶性維生素。長期以來，人們對VD的研究主要集中在鈣、磷代謝的調節作用，近年來，VD在抗腫瘤方面的研究受到越來越多的關注。大量研究表明，VD及其類似物可通過抑制腫瘤細胞增殖、浸潤與轉移、誘導細胞分化、促進細胞凋亡、抗血管生成等方式發揮抗腫瘤作用[4]。VD發揮生物學效應的受體是廣泛分布于體內諸多組織內的VD受體(vitamin D receptor，VDR)。目前，VDR與腫瘤的研究主要集中在乳腺癌、肺癌和結腸癌等[5-7]，關于VDR在食管鱗癌組織中的表達水平及與臨床病理特征、預后的相關性鮮有報道。本研究擬采用實時定量PCR法檢測食管鱗癌組織中VDR的表達水平，并分析其與臨床病理特征、預后之間的關系，探討VDR在食管鱗癌發生、發展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為回顧性研究，收集河南科技大學第一附屬醫院2012年1月至2014年12月具有明確病理學診斷的原發性食管鱗癌患者組織標本114例，其中男73例，女41例；年齡40～73歲，中位年齡61歲；淋巴結轉移者56例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期66例，Ⅲ期48例。另取其中50例手術切除的癌旁組織作為對照，全部標本收集后立即于-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol LS Reagent及TaqMan Expression Kit(美國，Invitrogen)；M-MLV逆轉錄酶、0.1 mM DTT、5×First Buffer、RNase Inhibitor和GADPH(美國，Applied Biosystems)。NanoDrop ND1000紫外可見分光光度計(美國，Thermo)，7900HT熒光定量PCR(美國，Applied Biosystems)。

1.3 實時定量PCR方法檢測VDR mRNA的表達水平取食管癌或癌旁組織標本100～200 mg，液氮中研磨成粉末狀；加入1 mL的TRIzol，混合均勻；加入200 μL氯仿，12 000 r·min-1，4 ℃離心30 min；加入等體積異丙醇，-20 ℃放置2 h；12 000 r·min-1，4 ℃離心30 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇，洗滌RNA，混勻；12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min；重復洗滌1次；NanoDrop紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度；1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA是否降解；稀釋至工作濃度(50 ng·μL-1)，-80 ℃保存。按照逆轉錄試劑盒進行cDNA合成，總反應體系為12 μL。逆轉錄反應條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 50 min，70 ℃15 min。cDNA 樣本在-20 ℃保存。按照TaqMan mRNA Assays的說明進行實時熒光PCR，檢測mRNA表達水平。每個PCR 反應體系為5 μL，設3個復孔，反應條件：95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；40個循環。以GADPH為內參，Log10(2-ΔΔCt)表示VDR mRNA相對表達量。

1.4 隨訪根據病歷信息進行隨訪，死于其他疾病、失訪或隨訪截止時間仍存活視為截尾數據。114例患者中死亡66例，均死于食管癌相關的并發癥或復發遠處轉移；總生存期(overall survival, OS)定義為確診日期至死亡日期或最近一次隨訪日期(2020年12月)。

1.5 統計學處理采用SPSS 19.0軟件包進行統計分析，采用 Log10(2-ΔΔCt)計算mRNA相對表達量，mRNA在癌和相應癌旁組織中的表達比較采用配對t檢驗，VDR mRNA表達水平與臨床病理特征的相關性采用χ2檢驗。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗生存時間的差異。α=0.05，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VDR mRNA在食管鱗癌及癌旁組織中的表達水平應用實時定量PCR方法檢測50例食管鱗癌及相應的癌旁組織中VDR mRNA的表達水平，結果顯示，VDR mRNA在食管鱗癌組織中平均表達水平(5.39 ± 0.52)低于癌旁組織(5.92 ± 0.54)，差異有統計學意義(t=4.958，P<0.05)。見圖1。

圖1 VDR mRNA在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達水平

2.2 VDR mRNA表達與臨床病理特征相關性分析進一步檢測VDR在114例食管鱗癌中的表達，利用VDR mRNA表達的中位值(5.550)將患者分成高表達、低表達兩組。如表1所示，VDR基因表達水平和性別(χ2=6.437，P=0.011)、吸煙(χ2=3.947，P=0.047)和淋巴結轉移相關(χ2=5.054，P=0.025)，差異有統計學意義。

表1 食管鱗癌組織中VDR mRNA表達與臨床病理特征的關系 例(%)

2.3 VDR mRNA表達與食管鱗癌預后的關系運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗比較生存時間的差異，分析VDR mRNA表達與食管鱗癌患者預后的相關性，圖2結果顯示，114例食管鱗癌患者術后VDR mRNA高表達組中位生存期為65.5個月，明顯高于低表達組(22.7個月)，提示VDR mRNA高表達與食管鱗癌患者生存預后較好有關(χ2=4.906，P=0.027)。

圖2 食管鱗癌中VDR mRNA高表達與低表達的生存曲線

3 討論

維生素D是一種脂溶性的類固醇衍生物，在骨代謝和鈣穩態中發揮重要作用，近年來研究發現，VD具有潛在的抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用機制包括抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉移、誘導細胞凋亡、促進細胞分化等。除此之外，VD還參與調節免疫、抑制炎癥等多個生物學過程[8]。VDR廣泛分布于小腸、腎、骨、皮膚、甲狀旁腺、結腸、乳腺、胰腺等正常組織中，同時也表達于這些組織的癌細胞中[9]。VD的生物學功能是通過與VDR結合調節靶基因轉錄來實現的，當游離的1,25(OH)2D3進入細胞后被轉移至核內，與VDR結合并使VDR發生磷酸化，從而導致VDR構象的改變，進而與類視黃醇X受體(retinoid X recepto，RXR)結合形成異質二聚體，VD-VDR復合物作為轉錄因子，作用于其靶基因啟動區中的特異DNA序列(維生素D反應元件，vitamin D responsive element，VDRE)，從而激活或抑制基因轉錄[10]。

VDR表達于大多數腫瘤細胞中，包括食管癌。既往VDR和食管癌的研究主要為腺癌，在食管腺癌中VDR表達水平隨著腫瘤去分化而下降。與食管正常鱗狀上皮相比，VDR在Barrett食管黏膜中的表達顯著升高[11-12]。在食管鱗癌細胞中VDR基因多態性和不良預后相關[13]。Mimori K等[14]研究發現，與正常食管組織相比，VDR在食管癌組織中表達較低，其低表達與預后較差相關，表現為腫瘤細胞的淋巴結轉移、浸潤侵襲及血行擴散能力增強。該研究提示VDR表達下調可能在食管癌的進展中發揮著重要作用，而VDR基因表達上調具有改善食管癌預后的潛在可能。另外，相關體外及動物模型研究表明，VD能抑制食管鱗癌細胞增殖，使細胞周期阻滯在G0/G1期，并誘導腫瘤細胞凋亡[15-16]。

本研究采用實時定量PCR法檢測VDR mRNA在食管鱗癌中的表達水平，并分析其與臨床病理特征及預后的相關性。研究發現VDR mRNA在食管鱗癌組織中的表達顯著低于相應的癌旁組織。VDR mRNA低表達與預后較差、生存時間較短相關。本研究結果與相關文獻報道一致[14]。除此之外，VDR mRNA表達與食管癌患者性別、吸煙及淋巴結轉移相關，提示VDR mRNA低表達在食管癌患者中男性多于女性，吸煙患者多于非吸煙患者，VDR mRNA低表達患者易發生淋巴結轉移。

綜上所述，本研究表明VDR mRNA在食管鱗癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，且其表達與患者的臨床病理類型及預后密切相關。VDR有望成為食管鱗癌預后的判斷指標及潛在的治療靶點。