復(fù)方參蛭膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

向澤棟，孫 平，薛 晴，李 震，劉國飛，高 鵬，代 龍

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2 山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 251200；3 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

復(fù)方參蛭方為人參、黃芪、紅曲、陳皮、水蛭、地龍等組成的中藥臨床常用復(fù)方制劑，具有活血化瘀、化瘀通絡(luò)的功效，臨床上常用于頸動(dòng)脈斑塊的治療，療效確切。方中主要成分為人參皂苷類、黃芪甲苷、橙皮苷、洛伐他汀以及其他多糖類、活性肽類成分，是復(fù)方參蛭方具有良好療效的指標(biāo)性成分[1-4]。為將復(fù)方參蛭方開發(fā)為中藥新藥，使其能夠服務(wù)于廣大人民群體，發(fā)揮中醫(yī)藥治療優(yōu)勢，本研究前期在臨床常用方基礎(chǔ)上，采取多種提取工藝對(duì)成分進(jìn)行提取，將傳統(tǒng)臨床復(fù)方制備成現(xiàn)代膠囊劑。為保障復(fù)方參蛭膠囊質(zhì)量的可控性、穩(wěn)定性和均一性，滿足臨床用藥安全需求，本研究在《中國藥典》2020版一部藥材項(xiàng)下相關(guān)方法結(jié)合文獻(xiàn)方法基礎(chǔ)上[5-8]，利用薄層色譜法鑒別了制劑中人參、黃芪、紅曲和陳皮等四味藥材，采用高效液相色譜法建立制劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量測定方法，為復(fù)方參蛭膠囊制劑的質(zhì)量控制提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀 器

Shimadzu LC2030高效液相色譜儀，日本島津公司；XS105DU電子分析天平(萬分之一)，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800型紫外-可見光分光光度計(jì)，日本島津公司；PHS-3C型pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；IKA VORTEX3旋渦混勻儀，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)：110703-201832，純度≥92.4%)、人參皂苷Re對(duì)照品(批號(hào)：110754-201827，純度≥93.4%)、人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)：110704-201726，純度≥91.1%)、人參皂苷Rf對(duì)照品(批號(hào)：111719-201806)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-201314)、橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：110721-201818)，均購自中國食品藥品檢定研究院。人參藥材(批號(hào)：200501、200403、200405)、黃芪藥材(200303、200502、200403)、紅曲藥材(200408、200403、200504)、陳皮藥材(200203、200206、200306)、水蛭藥材(200407、200302、200508)、地龍藥材(200403、200506、200409)。甲醇、乙腈為色譜純，美國TEDIA有限公司；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。HSG型薄層層析硅膠板，批號(hào)020200908，煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)方參蛭膠囊的制備

稱取水蛭、地龍粉末(過50目篩)，加10倍水煮沸15 min，待冷卻至40 ℃，以稀鹽酸調(diào)至pH約1.5，加0.5%胃蛋白酶，于40 ℃保溫酶解4 h，以20%氫氧化鈉溶液調(diào)pH約8.0，加1.5%胰蛋白酶，于40 ℃保溫酶解2 h，調(diào)節(jié)pH約7.0，于85 ℃水浴15 min殺酶，離心取上清液；取黃芪、陳皮加8倍量水浸泡45分鐘后回流提取2次，每次1.5 h，濾過；取人參、紅曲加8倍量70%乙醇浸泡1 h后回流提取2次，每次1.5 h，濾過。合并電滲析脫鹽的酶解液與水提取液于(70±5) ℃左右減壓濃縮，乙醇提取液于(70±5) ℃左右減壓濃縮(真空度-0.08 MPa)至相對(duì)密度1.25～1.30(60 ℃)，合并濃縮液于(70±5) ℃左右真空干燥(真空度-0.08 MPa)，干浸膏粉碎成細(xì)粉(過65目篩)，加入微粉硅膠1.0 g，并加入微晶纖維素至總量為510 g，混合均勻，裝入0號(hào)膠囊制成1000粒，裝樣量為0.51 g/粒，即得。

1.3.2 薄層鑒別

(1)人參供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物1 g，置具塞錐形瓶中，加水1 mL潤濕，加水飽和正丁醇20 mL，超聲處理30 min，吸取上清液加30 mL氨試液洗滌2次，放置分層取上層液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取人參對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf及人參皂苷Rg1對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。按制劑的處方和工藝制備缺人參的陰性樣品，按同法制備缺人參陰性對(duì)照溶液。

(2)黃芪供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物2 g，置具塞錐形瓶中，加水20 mL使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇層，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次50 mL，合并正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，通過D101大孔吸附樹脂，先后以用 2 倍柱體積水，2倍柱體積 40%乙醇溶液，棄去洗脫液，收集3倍柱體積70%乙醇溶液的洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含黃芪甲苷0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按制劑的處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，按同法制備缺黃芪陰性對(duì)照溶液。

(3)紅曲供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物1 g，置具塞錐形瓶中，加75%乙醇10 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液作為供試品溶液。另取洛伐他汀對(duì)照品加75%乙醇制成每1 mL含洛伐他汀0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按制劑的處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，按同法制備缺紅曲陰性對(duì)照溶液。

(4)陳皮供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物1 g，置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)80 mL，加熱回流4～5 h，棄去石油醚，揮干藥渣，加甲醇20 mL超聲30 min，濾過，取濾液濃縮至2 mL作為供試品溶液。另取橙皮苷對(duì)照品加甲醇制成飽和溶液，作為對(duì)照品溶液。按制劑的處方和工藝制備缺陳皮的陰性樣品，按同法制備缺陳皮陰性對(duì)照溶液。

1.3.3 含量測定

對(duì)照品溶液制備：取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品及人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得。

供試品溶液制備：取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞放置過夜，超聲處理(250 W，40 kHz)30 min，濾過，精密移取續(xù)濾液25 mL，加入氨試液洗滌2次，每次25 mL，取正丁醇層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照溶液：按復(fù)方參蛭膠囊的處方和工藝制備缺人參的樣品，再按供試品溶液制備方法制成缺人參的陰性對(duì)照溶液。

色譜條件：COSMOSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～35 min, 19%A; 35～55 min, 19%～29%A; 55～50 min, 29%A; 70～100 min, 29%～40%A。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層鑒別

2.1.1 人 參

照薄層色譜法(中國藥典2020年版通則0502)試驗(yàn)[9]，吸取上述人參供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)在10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑展開，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖1)。

圖1 復(fù)方參蛭膠囊中人參的TLC鑒別

2.1.2 黃 芪

照薄層色譜法(中國藥典2020年版通則0502)試驗(yàn)，吸取黃芪供試品溶液、黃芪甲苷對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(10:1:1:1)為展開劑展開，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，分別于日光和紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)；紫外光燈(365 nm)下顯相同的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖2)。

圖2 復(fù)方參蛭膠囊中黃芪的TLC鑒別

2.1.3 紅 曲

照薄層色譜法(中國藥典2020年版通則0502)試驗(yàn)，吸取紅曲供試品溶液、洛伐他汀對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮(4:1)為展開劑展開，取出晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖3)。

圖3 復(fù)方參蛭膠囊中紅曲的TLC鑒別

2.1.4 陳 皮

照薄層色譜法(中國藥典2020年版通則0502)試驗(yàn)，吸取陳皮供試品溶液、橙皮苷對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17:13)為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾(圖4)。

圖4 復(fù)方參蛭膠囊中陳皮的TLC鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 專屬性試驗(yàn)

分別吸取供試品、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液各10 μL進(jìn)行測定。結(jié)果見圖5～圖7，供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜峰相同保留時(shí)間處有色譜峰出現(xiàn)，陰性色譜圖中，在與對(duì)照品色譜峰相同保留時(shí)間無色譜峰出現(xiàn)，因此缺人參陰性樣品無干擾，表明該方法專屬性好。

圖5 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液色譜圖

圖6 復(fù)方參蛭膠囊供試品溶液色譜圖

圖7 復(fù)方參蛭膠囊人參陰性溶液色譜圖

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.76%、0.64%、0.76%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 線性與范圍

表1 3種人參皂苷線性回歸方程與線性范圍

精密稱取人參皂苷Rg113.51 mg、人參皂苷Re 12.64 mg、人參皂苷Rb113.96 mg對(duì)照品，置25 mL量瓶中加入甲醇至刻度，搖勻，得人參皂苷Rg10.4993 mg/mL、人參皂苷Re 0.4722 mg/mL、人參皂苷Rb10.5087 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。精密吸取1、2、4、8 mL對(duì)照品溶液于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得到不同濃度的對(duì)照品溶液，與母液分別注入液相色譜儀各10 μL進(jìn)行測定，以3個(gè)成分的質(zhì)量濃度 (X, mg/mL) 為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積 (Y) 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到3個(gè)成分的線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表1。結(jié)果表明3種人參皂苷在進(jìn)樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.58%、0.53%、0.74% (n=6)，表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取復(fù)方參蛭膠囊內(nèi)容物6份，每份稱取約1g，精密稱定，按“1.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種人參皂苷的含量。結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的平均含量分別為1.4682、1.2648、1.7859 mg/g，RSD分別為0.45%、0.44%、0.54% (n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率

精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加水飽和正丁醇配制為每1 mL含人參皂苷Rg10.7337 mg、人參皂苷Re 0.6359 mg、人參皂苷Rb10.8935 mg的混合對(duì)照品溶液25 mL。分別精密吸取4、5、6 mL混合對(duì)照品溶液于250 mL量瓶中，加入水飽和正丁醇至刻度，備用。取已知含量的樣品約0.5 g共9份，精密稱定，置于錐形瓶中，按取樣含量的80%、100%、120%精密加入混合對(duì)照品溶液，每組平行測定3次，按“1.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。

表2 人參皂苷Rg1 、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1加樣回收率試驗(yàn)

2.2.7 樣品測定

取3批樣品，按“1.3.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種人參皂苷的含量，3批藥材制備的復(fù)方參蛭膠囊樣品中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量見表3。

表3 三批樣品中人參皂苷Rg1 、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量

3 結(jié) 論

在人參含量測定的方法學(xué)考察試驗(yàn)中，前期采用藥典《中國藥典》2020版一部人參藥材項(xiàng)下含量測定提取方法，發(fā)現(xiàn)方中其他成分帶來的雜質(zhì)對(duì)人參皂苷Rb1分離的影響較大，因此選擇用氨溶液洗滌水飽和正丁醇提取液，除去部分酸性雜質(zhì)，人參皂苷Rb1得到較好分離，達(dá)到含量測定的要求。同時(shí)本研究還考察了人參含量測定色譜條件的耐用性，發(fā)現(xiàn)溫度(25、30、35 ℃)和流速(0.8、1、1.2 mL/min)的改變對(duì)3種人參皂苷的分離度均無顯著影響，因此本研究建立的制劑中人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量測定方法的耐用性好，可行度高。

本研究前期優(yōu)選了復(fù)方參蛭膠囊的制備工藝，得到膠囊劑成品，以此為基礎(chǔ)建立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效的控制藥品質(zhì)量。本研究依據(jù)《中國藥典》2020版一部藥材項(xiàng)下相關(guān)方法結(jié)合文獻(xiàn)方法，建立了鑒別制劑中人參、黃芪、紅曲、陳皮的薄層方法，得到的薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，無陰性干擾，能較好的對(duì)復(fù)方參蛭膠囊制劑進(jìn)行定性鑒別。本研究依據(jù)《中國藥典》2020版一部人參藥材項(xiàng)下含量測定的方法及相關(guān)文獻(xiàn)，建立了制劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的HPLC含量測定方法，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以對(duì)復(fù)方參蛭膠囊制劑進(jìn)行有效定量控制。