高效液相色譜法測定葉下珠沒食子酸含量的研究*

唐 藝，李 昆，許 斌，陳舒憶

(貴陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,貴州 貴陽 550081)

葉下珠為大戟科植物葉下珠Phyllanthusurinaria Linnaeus 的干燥全草，有平肝清熱、利水解毒的功效[1]，臨床上，葉下珠多用于慢性乙型病毒性肝炎的治療[2]。葉下珠的活性成分較多，其中沒食子酸含量最高，有抗炎、抗突變、抗氧化、抗腫瘤活性。本文對葉下珠的含量測定方法進(jìn)行研究，為葉下珠的質(zhì)量控制提供一定的依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent1260，安捷倫；電子天平BSA224S，賽多利斯；水浴鍋DFD-700，天津市泰斯特；沒食子酸對照品(批號：110831-201605)，中國食品藥品檢定研究院。色譜純甲醇(4 L/瓶)，默克化工技術(shù)；鹽酸、磷酸(500 mL/瓶)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

10批不同產(chǎn)地的葉下珠(見表1)，采集部位均為全草，并由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthusurinaria L.。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 液相色譜條件

InretSustain C18色譜柱(4.6×250 mm，5.0 μm)，甲醇-0.2%磷酸溶液(12:88)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測波長273 nm。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

1.3.2 溶液的制備

取葉下珠粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15%鹽酸溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用15%鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 mL，用50%甲醇定容至10 mL，得供試品溶液。取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜中測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

通過查閱藥典，沒食子酸的含量測定的前處理方法有兩種方式，甲醇提取和鹽酸溶液提取。故分別采用40%甲醇、50%甲醇、10%鹽酸、15%鹽酸、20%鹽酸進(jìn)行回流和超聲進(jìn)行提取測定，定容體積均為25 mL。結(jié)果顯示，用15%鹽酸溶液回流1 h進(jìn)行提取測定沒食子酸含量最高，故選擇此方法。

2.2 色譜條件的確定

參照相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]，對不同的流動(dòng)相和柱溫進(jìn)行相關(guān)研究，在甲醇-0.2%磷酸溶液(12:88)，柱溫25 ℃時(shí)，葉下珠藥材的色譜分離效果良好，沒食子酸成分能被有效定量，見圖1。

圖1 沒食子酸對照品和葉下珠的HPLC圖譜

2.3 10批不同產(chǎn)地的葉下珠的沒食子酸含量

表1 樣品來源表和沒食子酸含量

2.4 回收率、精密度、耐用性和線性考察

2.4.1 回收率

表2 沒食子酸的回收率

精密稱取6份同一批次樣品，其中對照品沒食子酸加入量與葉下珠含量為 1:1，進(jìn)行回收率測定，回收率范圍在98%～100%，結(jié)果見表2。

2.4.2 精密度

將6份同一批次樣品，進(jìn)行沒食子酸含量的測定，RSD為1.0%，結(jié)果見表3。

表3 沒食子酸的精密度

2.4.3 耐用性

對同一批次樣品的沒食子酸含量的耐用性(穩(wěn)定性)進(jìn)行考察，選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上機(jī)分析。結(jié)果表明，沒食子酸峰面積在26 h內(nèi)無明顯變化，RSD為0.4%，且保留時(shí)間穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

表4 沒食子酸的耐用性(穩(wěn)定性)

2.4.4 線 性

將沒食子酸對照品溶液稀釋為0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。結(jié)果表明，沒食子酸在0～40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好(r>0.9999)。

3 結(jié) 論

高效液相色譜法是中藥材質(zhì)量檢測常用的方法，可以準(zhǔn)確的評估藥材的含量是否達(dá)標(biāo)，從而保證藥材質(zhì)量。本文研究建立了葉下珠含量測定方法，實(shí)驗(yàn)處理方法簡單便捷，回收率高，精密度、線性、穩(wěn)定性均符合要求，可作為葉下珠藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定的方法。