干姜化學成分的分離及抗腫瘤活性成分篩選*

陳 靖，柴 玲，譚 敏

(1 常德職業(yè)技術(shù)學院藥學系，湖南 常德 415000；2 廣西中醫(yī)藥研究所 廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022)

干姜 (Rhizoma Zingiberis) 源自姜科植物姜(ZingiberofficinaleRose.)的干燥根莖，是常用藥食同源的中藥材。干姜具有極好的藥用價值，為《本草綱目》、《本草經(jīng)疏》等記載。其性熱味辛，功效為溫中散寒，回陽通脈，溫肺化飲[1]。

臨床上主要用于治療腸炎、腹瀉、嘔吐、外感風寒、冠心病、心肌梗塞、手足皸裂等疾病[2]。干姜主要含有揮發(fā)油類成分，現(xiàn)代藥理學研究表明，干姜及其活性成分對肺癌[3]，結(jié)腸癌[4]，胃癌[5]，肝癌[6]，白血病細胞[7]具有抗腫瘤作用。近年來，美國及歐洲各國開始將干姜用于食品添加劑中[8]。由此可見，干姜作為一種藥食同源的中藥材，在當前中醫(yī)臨床中應用廣泛，其藥效顯著，且毒副作用小。因此為了深入探討干姜的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，加強對干姜活性成分的系統(tǒng)研究和開發(fā)利用，我們對其進行了化學成分及抗腫瘤活性研究。

1 材料與儀器

1.1 儀器與設備

常規(guī)分析采用島津LC-10A VP高效液相色譜系統(tǒng)(包括(LC-10AD二元泵、SIL-10AD自動進樣器、LC-10A系統(tǒng)控制器和SPD-10A UV-VIS檢測器)，日本島津株式會社；色譜工作站采用島津CLASS-VP Ver6.12 SP4色譜工作站；BüCHI Rotavapor R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BüCHI公司；BP211D十萬分之一天平，德國Sartorius公司；Labconco凍干機，美國Labconco公司； 生物安全柜，蘇州凈化設備有限公司；細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；Victor 3多功能酶標儀，美國Perkin Elmer公司；恒溫水浴鍋，德國LAUDA公司；高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司。

1.2 材料與試劑

姜超臨界流體萃取所得的姜油樹脂，廣州和博生物科技有限公司有限公司；甲醇(色譜純)，江蘇漢邦科技分析有限公司；乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)，美國Tidea公司；水為超純水，(Millipore，Bedford，MA，USA)制備。其它試劑均為分析純。

肝癌細胞株SMMC-7721，Bel-7404, HL-7702均購自中科院上海細胞庫。HepG2細胞購自美國ATCC細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清，胰酶等細胞培養(yǎng)用試劑購自美國Gibco公司；MTT購自美國Sigma公司。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

稱取約50 mg姜油樹脂，溶解至1 mL。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18，4.6×150 mm，5 μm；流動相為A：純水，B乙腈；梯度洗脫：0～9.0 min，B相80%；9.0～10.0 min，B相80%～100%；10.0～20.0 min；B相100%；20.0～21.0 min，B相100%～80%；21.0～25.0 min；B相80%)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：15 μL。根據(jù)DAD光譜及出峰順序，分別判斷其中1～5號主要色譜峰。

圖1 HPLC-UV 姜油樹脂色譜圖

圖2 HPLC-UV 姜油樹脂分離色譜圖

2.2 化合物累積

稱取約250 mg姜油樹脂，用甲醇溶解至1 mL。每次分析進樣15 μL，色譜條件如前述。其色譜如圖2所示。根據(jù)保留時間分辨每個化合物的出峰時間。按出峰時間精確收集色譜峰尖端，即可得到分別包含各個化合物的餾分。收集時的時間順序見表1。各個餾分在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸去乙腈后凍干，所得化合物-70 ℃冷凍保存。

表1 HPLC分離姜油樹脂采集時間

2.3 化合物純化

上步所得粗品經(jīng)分析型HPLC進一步純化，將其純度進一步提高。各個化合物餾分通過HPLC-UV法，經(jīng)峰面積歸一化法確定，其純度高于98%。

2.4 抗腫瘤活性篩選

2.4.1 給藥藥物制備

將從干姜中分離得到的5個姜酚類化合物用無血清培養(yǎng)基配置成5, 10, 20, 40, 80, 160，320 μM濃度的藥物溶液；將干姜提取物配置成10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 μM濃度的藥物溶液。

2.4.2 MTT試驗

將細胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。所有試驗均選取對數(shù)生長期的細胞。

用0.125%胰酶消化并收集細胞，以每孔1×104個細胞鋪96孔板。培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基吸出，加入不同濃度的藥物(用RPMI1640培養(yǎng)基將6-shogaol分別稀釋成5、10、15、20、25、30 μM)，每濃度做4個平行孔，另設空白孔和對照孔。藥物作用期間，在不同時間點用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學變化與生長情況。

藥物作用24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出細胞培養(yǎng)板，吸出上清，每孔加DMSO100 μL，震蕩均勻，使紫色結(jié)晶物充分溶解，用酶標儀，波長490 nm測定各孔的吸光度(OD)值，按下列公式計算細胞抑制率。

將細胞用不同濃度的藥物分別處理3，6，12，24 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

3 實驗結(jié)果

3.1 化合物鑒定

將分離純化得到的化合物TOF/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)與標準品比對，鑒定出化合物1為 6-gingerol；化合物2為 8-gingerol；化合物3為 diacetoxy-6-gingerdiol；化合物4為 6-shogaol；化合物5為 10-gingerol，質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2。結(jié)構(gòu)見圖3。

表2 姜油樹脂中的化合物鑒定

圖3 姜油樹脂中化合物的結(jié)構(gòu) (A) n=4 6-gingerol，n=6 8-gingerol, n=8 10-gingerol; (B) 6-shogaol;(C) diacetoxy-6-gingerdiol

3.2 抗腫瘤活性分析

MTT實驗篩選結(jié)果表明干姜中6-gingerol，6-shogaol及干姜提取物對肝癌細胞均有細胞毒性，其中6-gingerol對肝癌細胞毒性作用沒有線性關(guān)系，起效濃度高。160 μM以下對該癌細胞沒有毒性，320 μM細胞毒性顯著上升。干姜提取物40 μg/mL為起效濃度，60 μg/mL作用24 h可致細胞急速死亡。而6-shogaol對肝癌細胞有細胞毒性且呈濃度依賴性。其中對SMMC-7721細胞毒性最為明顯。20 μM 6-shogaol 作用24 h約抑制50% SMMC-7721細胞增殖，如圖4所示。正常培養(yǎng)條件下的SMMC-7721細胞為飽滿的多邊形，貼壁生長，相鄰細胞生長融合成片，細胞均勻生長，狀態(tài)良好。經(jīng)6-shogaol處理后，細胞間連接消失，細胞由貼壁逐漸脫落，胞體變圓，收縮，細胞分散生長，細胞形態(tài)變得模糊，不完整，如圖5所示。

圖4 6-shogaol對肝癌細胞的細胞毒性

圖5 20 μM 6-shogaol 處理SMMC-7721細胞24 h后的形態(tài)學變化

4 討 論

4.1 分離姜油樹脂中化合物的方法

采用分析型HPLC反復進樣，累積目標餾分的方法分離富集目標化合物，這種方法要求將樣品制成盡可能濃的溶液，摸索適宜進樣量，盡可能增加進樣量而不致超載。本實驗表明，用分析型HPLC累積的姜中主要成分是可行的。特別是對于含量小、極性相近，采用傳統(tǒng)分離方法不易分離得到的化合物，采用分析型HPLC能很容易檢測并分離得到。另外此方法累積化合物，分析條件簡單容易摸索，與傳統(tǒng)分離方法比較，可大大縮短所需化合物的分離時間，可應用于mg級別化合物的短期快速累積。

4.2 抗腫瘤活性成分的篩選

抗腫瘤作用篩選結(jié)果表明，干姜提取物及干姜姜油樹脂中的6-gingerol、6-shogaol有肝癌細胞毒性，6-gingerol和干姜提取物對細胞呈急劇性死亡沒有濃度依賴性，而6-shogaol對肝癌細胞毒性呈濃度依賴性。本研究工作為干姜中活性成分的研究找到了很好的天然資源，也為干姜后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。