黔產八角蓮超聲提取工藝的優化*

孫曉惠，陸錦銳，胡志平，陸廷祥，楊政菊

(黔南民族醫學高等專科學校，貴州 黔南 558000)

黔產八角蓮屬藥材主要為八角蓮[Dysosma versipellis(Hance)M.ChengexYing]、貴州八角蓮[D. majorensis (Gagnep.)Ying]、川八角蓮[D. veitchii (Hemsl. et Wils.)FuexYing]和小八角蓮[D. difformis (Hemsl.et.Wils.)T.H.WangexYing][1]。具有化痰散結、祛瘀止痛、清熱解毒的功效，臨床用于治療多種癌癥以及咳嗽、咽喉腫痛、瘰疬、癭瘤、跌打損傷、風濕痹痛、瘡瘍腫毒、蛇蟲咬傷等證[2]。化學成分研究發現本品根及根莖含有抗癌成分鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚等[3]，具有廣闊的開發前景。目前有關八角蓮中鬼臼毒素等成分提取工藝的研究僅見其回流提取[4-5]，故本實驗對其超聲提取工藝進行優化，為工業生產提供基礎。

1 儀器和試劑

1.1 儀 器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；KQ3200超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司；JA2003N電子天平，上海菁海儀器有限公司；2500C多功能粉碎機，永康市艾澤拉電器有限公司。

1.2 試 劑

鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚標準品，均購自北京百靈威科技有限公司，編號分別為131142、203057、268623、258643；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

1.3 藥 材

主要對貴州都勻、荔波、福泉、赫章等縣市的八角蓮屬藥材資源進行了野外考察和樣品收集，收集的八角蓮屬藥材樣品由黔南民族醫學高等專科學校生藥教研室王傳明副教授鑒定，分別為八角蓮Dysosma versipellis(Hance)M.ChengexYing、貴州八角蓮D. majorensis (Gagnep.)Ying、川八角蓮D.veitchii (Hemsl.et Wils.)FuexYing和小八角蓮D.difformis (Hemsl.et.Wils.)T.H.WangexYing。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

精密稱取鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚標準品適量，加甲醇分別制成濃度為1.530、0.0212、0.1490、0.2040 mg/mL的溶液。

2.1.2 供試品溶液

精密稱取過三號篩的藥材粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加50 mL甲醇稱定質量，超聲30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 HPLC測定鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm,5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：290 nm。流動相為A乙腈，B 0.1%磷酸溶液。梯度洗脫條件：0～15 min B 75%～70%;15～25 min B 70%-50%。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

2.2.2 線性關系考察

精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋成相應質量濃度，在“2.2.1”項色譜條件下進樣20 μL測定。以溶液質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程分別為

鬼臼毒素：Y=11508X+150.99，R=0.9999

4′-去甲基鬼臼毒素：Y=12566X+1.2391，R=0.9999

槲皮素：Y=25239X-8.3921，R=0.9999

山奈酚：Y=31778X-16.622，R=1.0000

分別在65.68×10-3～3.049 mg/mL、0.9359×10-3～0.04233 mg/mL、7.460×10-3～0.2990 mg/mL、10.27×10-3～0.4084 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗

取鬼臼毒素標準品20 μL自動進樣，重復6次，測定峰面積，結果鬼臼毒素的RSD為0.72%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性試驗

精密稱取同一藥材粉末6份，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.1”項下進樣測定。測得各成分含量RSD分別為1.06%(鬼臼毒素)、0.89%(4′-去甲基鬼臼毒素)、1.12%(槲皮素)、0.93%(山奈酚)(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.2.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液分別在0，2，4，8，12，16，24 h進樣20 μL，依法測定峰面積，結果RSD分別為0.39%、1.79%、1.38%、0.60%，表明供試品溶液在制備后24 h內穩定。

2.2.6 加樣回收率試驗

精密稱取12份已知含量的藥材粉末(每份0.5 g)，3份作為對照，另外9份分成低、中、高3組(n=3)，分別加入低、中、高3個不同濃度的混合對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下，進樣20 μL，測定4個成分的峰面積，計算回收率，結果各成分的平均加樣回收率分別為102.7%(鬼臼毒素)、99.2%(4′-去甲基鬼臼毒素)、101.5%(槲皮素)、98.9%(山奈酚)，RSD分別為1.5%、2.1%、2.5%、2.3%。

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗結果

根據預實驗及相關文獻，確定料液比A、甲醇體積分數B、提取時間C作為影響因素，各因素取3水平，設計L9(34)正交試驗。因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析

由表2可知，各因素對提取效果的影響程度依次為B>A>C，即甲醇體積分數>料液比>提取時間；由表3可知，因素B有顯著性影響(P<0.05)，而因素A、C無顯著性影響；最優工藝為B2A1C3，即甲醇體積分數80%，料液比1:10，提取時間40 min。

2.3.2 驗證試驗

精密稱取6份藥材粉末，按“2.3.1”項下最優提取條件制備供試品溶液，測得4種成分總含量平均為13.15 mg/g，高于表2最高值12.81 mg/g，表明工藝穩定可行。

3 結 論

實驗首次對黔產八角蓮根莖中鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚4種成分進行了超聲提取工藝研究，最優的提取工藝是用80%甲醇，料液比1:10，超聲提取時間為40 min。超聲提取八角蓮方法工藝簡單、方便、穩定、可行，可用于八角蓮中化學成分的提取。