量子力學研究天然牛磺酸與DNA的相互作用*

廖 娟，玉 葉，王建超，文 彬，鄧 鑫

(1 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001; 2 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011)

量子力學是研究物質世界微觀粒子運動規律的物理學分支，主要研究原子、分子、凝聚態物質，以及原子核和基本粒子的結構、性質。量子力學應用在生命科學中，主要用量子力學原理，通過數學運算來研究生物分子間的相互作用或作用方式，生物分子的電子結構與反應活性，生物大分子的空間結構與功能等[1]。DNA是生命體內重要的遺傳物質，是基因表達的物質基礎，它控制著蛋白質的合成，同時也是許多藥物的靶向分子。藥物是處在一個生物大分子和其他物質等所包圍的復雜環境之中，藥物與DNA相互作用也會影響到藥物在生物體內各方面的性質，研究藥物與DNA的相互作用，對藥物的作用機制以及以核酸為靶標的藥物分子的設計有一定的意義，將在臨床用藥治療以及和新藥的探索有著非常必要且重要的意義。

DNA分子雙鏈間的螺旋型凹槽，有著空隙不等的大溝和小溝。深的為大溝，位于相毗鄰的雙鏈之間，較淺的為小溝位于雙螺旋的互補鏈之間。在大溝和小溝內的堿基對中的N和O原子朝向分子表面，這些勾槽都有可能是藥物與DNA作用的靶點。大溝區域是蛋白質大分子與DNA的特異性結合的位置，是蛋白質識別的堿基序列并發生相互作用的基礎，且溝區足夠大，允許蛋白質大分子的進入。然而，小溝的信息則少一些，小分子藥物其體積小，更容易結合在DNA的小溝區。小分子藥物與 DNA主要通過以下三種結合模式發生相互作用：分別為靜電結合、溝區結合和嵌插結合[2]。

天然牛磺酸具有膜穩定、滲透調節和細胞保護作用、抗氧化和抗炎作用以及調節細胞內鈣濃度和離子通道等功能[3]，牛磺酸在動物體內以原形排泄或與膽酸結合成牛磺膽酸，肌注和口服的生物利用度較高[4]，但天然牛磺酸在體內的藥理作用尚未完全明了，本研究用光譜法、粘度法探究天然牛磺酸與DNA分子的相互作用，推測天然牛磺酸與DNA分子的結合方式、結合作用力。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

CARY8454紫外分光光度計，美國； Labsolutions RF熒光分光光度計，日本島津；烏氏粘度計(毛細血管內徑 0.55 mm)。

天然牛磺酸從烏蛤中提取，采用薄層色譜法定性定量檢測牛磺酸(牛磺酸含量達到98%以上)；pH 為7.4 的 1M Tris HCI Buffer 緩沖液，購自福州飛凈生物科技有限公司；小牛胸腺 DNA(ct-DNA)、吖啶橙(AO)，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 紫外線光譜的測定

在1 cm的石英比色皿中加入3 mL天然牛磺酸溶液,參比池中加入相同體積的雙蒸水，掃描190～400 nm波長范圍內的天然牛磺酸吸收光譜Ι0后，同時向參比池和樣品池中逐漸加入相同體積(10 μL/L)的DNA緩沖液，混合均勻后靜置15 min，掃描DNA緩沖液與天然牛磺酸相互作用后的吸收光譜Ι。根據公式(1)計算雙倒數可求得結合常數KA[5]：

1/(A-A0)=1/A0+1/(KA×A0×CDNA)

(1)

式中：A0表示天然牛磺酸溶液在260 nm時的吸光度，A為加入DNA緩沖液后260 nm處的吸光度，KA為結合常數，CDNA為DNA緩沖液的濃度。

1.3 熒光光譜的測定

1.3.1 牛磺酸溶液對DNA緩沖液的熒光影響

不同濃度的DNA緩沖液存在下天然牛磺酸溶液的熒光光譜的變化：在Ex:312 nm，Em:330～650 nm，Ex，Em slit=5 nm，PMT Voltage:700 V的實驗條件下，在1 cm的四面通光石英比色皿中加入3 mL天然牛磺酸溶液，測定天然牛磺酸溶液熒光光譜，之后向比色皿中逐漸加入等量的DNA緩沖液(10 μL/次)，混合均勻后靜置15 min，測定DNA緩沖液對天然牛磺酸溶液的熒光光譜，測熒光強度，觀察熒光光譜的變化。

1.3.2 牛磺酸對DNA緩沖液的淬滅反應

天然牛磺酸對DNA-AO復合體系熒光光譜的影響(熒光淬滅實驗)：在Ex:495 nm，Em:510～650 nm，Ex，Em slit=5 nm，PMT Voltage:700 V的實驗條件下，在1 cm的四面通光石英比色皿中加入3 mL DNA緩沖液，測定熒光光譜后，取等量的AO溶液加入另一個石英皿中，測定熒光光譜，取DNA緩沖液3 mL加入試管中，并加入濃度為5.05×10-6mol·L-1的AO溶液15 μL，定容至5 mL后，取3 mL該溶液至比色皿中測量其熒光強度，觀察DNA與AO結合后熒光增強反應。隨后，測定DNA-AO溶液(CDNA/CAO=20)熒光強度F0，向溶液中逐漸加入等量的不同濃度的天然牛磺酸溶液，測熒光強度F，觀察隨著天然牛磺酸溶液的加入對DNA-AO溶液的熒光光譜的影響。根據經典的Stern-Volmer方程(式2)當溫度一定時，F0/F～KQ呈線性關系，以F0/F～[Q]作圖，所得直線的斜率可求出KQ值。

F0/F=1+KQ[Q]

(2)

式中：F0/F為未加入淬滅劑時溶液的熒光強度F0與加入給定濃度的淬滅劑時溶液的熒光強度F的比值；KQ為Stern-Volmer淬滅常數，Q為淬滅劑的濃度。

1.4 粘度法

將恒溫槽中水浴溫度恒定在25 ℃，粘度計中加入20 mL DNA緩沖液，測定溶液通過毛細管所花費的時間t0(s)，之后逐漸加入天然牛磺酸溶液(10 μL/次)，測定混合溶液流過毛細管所花費的時間t(s)。按式(3)計算相對粘度η：

η= (t-t0)/t0

(3)

式中：t0位緩沖液流經毛細管所需時間，t為DNA緩沖液(含濃度不等的天然牛磺酸)流經毛細管所需時間，η0為沒有加入天然牛磺酸時DNA緩沖液的相對粘度。以(η/η0)1/3對結合比率r(r=C天然牛磺酸/CDNA)作圖，看曲線趨勢可知粘度變化。

2 結果與討論

紫外線吸收光光譜法根據電子躍遷光譜，吸收光波長范圍為200～400 nm，用于結構鑒定和定量分析。天然牛磺酸溶液與DNA緩沖液的吸光度如圖1(a)所示，吸收光較弱，隨著DNA緩沖液的逐漸加入，吸光譜出現了逐漸的增強，并波峰往右移(如圖1(b))。已知由于嘌呤和嘧啶基團中含有發色基團，ctDNA在260 nm處有特殊的π→π*帶，因此在天然牛磺酸溶液中隨著DNA緩沖液的加入，此封逐漸增強，在190～200 nm處為天然牛磺酸的吸收峰，逐漸加入DNA緩沖液時，此處峰值增強并右移，有可能是由于兩者結合導致了ctDNA氫鍵的破壞，引起π→π*電子的躍遷，共軛延長，因此吸光譜出現增色反應，并有輕微的紅移現象。根據雙倒數公式，求得結合常數KA=1.68×104L·mol-1，說明天然牛磺酸與DNA發生了相互作用，引起了構象的變化，但EB與DNA的結合常數為1.4×106L·mol-1，即天然牛磺酸與DNA結合力度較EB小，也有可能存在其他方式的相互作用。

圖1 天然牛磺酸溶液加入DNA后紫外線吸收光譜變化

天然牛磺酸溶液熒光光譜如圖2所示，逐漸加入DNA緩沖液后(10 μL/次)，天然牛磺酸溶液的熒光光譜出現了有規律的增強(a→b)，峰值未見明顯紅移或藍移現象。天然牛磺酸是一種熒光強度較低的物質，加入DNA緩沖液時，可能自身的熒光淬滅受到了抑制，出現熒光增強的反應，但這也可能是DNA的發光團增加的作用。

圖2 加入DNA后天然牛磺酸的熒光光譜變化

DNA是熒光強度較低的物質，AO是一種熒光色素[6]，與DNA以經典嵌插方式相結合，能嵌插入DNA堿基對之間，形成DNA-AO復合物后可以出現較高的綠色熒光，能更好的辨別熒光反應，對比單純DNA緩沖液和純AO溶液的熒光強度如圖3所示。

圖3 DNA與AO、DNA-AO復合物熒光強度對比

圖4 天然牛磺酸競爭DNA-AO復合物的熒光光譜變化

若配體AO結合位點相同，則會通過位點競爭置換出AO，使熒光強度逐漸降低，出現有規律的淬滅反應。在逐漸加入天然牛磺酸后，熒光強度確實出現逐漸降低，推測是由于天然牛磺酸與AO競爭DNA上的作用位點，因此出現有規律的熒光淬滅反應，如圖4左側所示，根據經典的Stern-Volmer方程[7]：F0/F=1+KQ[Q]，用F0/F對[Q]作出Stern-Volmer曲線圖，如圖4右側，求其斜率可以得出KQ=2.944。

粘度法是研究小分子藥物與DNA相互作用的經典方法之一[8]。其插入DNA的堿基對后與堿基對重疊排列，并依靠氫鍵、范德華力和大環的π-π堆積作用而產生較穩定的結構，受離子強度的影響小，故粘度法是嵌插方式結合的最有說服力的研究方法。恒溫槽中水浴溫度恒定在25 ℃，粘度計中加入20 mL DNA緩沖液，測定溶液通過毛細管所花費的時間t0(s)，之后逐漸加入天然牛磺酸溶液10 μL/次，測定混合溶液流過毛細管所花費的時間t(s)。按式η=(t-t0)/t0計算相對粘度，以(η/η0)1/3對結合比率r(r=C天然牛磺酸/CDNA)作圖，如圖5所示，隨著天然牛磺酸濃度的加大，粘度也出現逐漸的增大，DNA雙鏈為融入小分子藥物而被拉長[9]，提示天然牛磺酸可能以嵌插的方式與DNA結合，與熒光結果相對應。

圖5 (η/η0)1/3對結合比率r(r=C天然牛磺酸/CDNA)

3 結 論

(1)通過紫外-可見吸光光譜法、熒光光譜法、粘度法探討天然牛磺酸與DNA分子的相互作用。結果顯示天然牛磺酸與DNA發生了相互作用，可能主要通過嵌插結合方式，其結合常數為1.68×104L·mol-1，淬滅常數為2.944，其作用力類型可能是氫鍵或者范德華力。

(2)本研究僅使用了紫外可見吸收光譜法、熒光光譜法、粘度法做了基礎研究，用化學計量學方法對光譜結果做出了定量分析天然牛磺酸與DNA相互作用，推測可能的作用力類型和結合能力，但未能進一步探明兩者結合后的空間構象如何變化，結合后DNA雙鏈結構更加穩定，結合在有表達意義的DNA片段上還是在無意義的外顯子上是未知的，但結合后對DNA的轉錄、翻譯等是否存在影響或者怎樣發生作用尚未可知，是否通過嵌插方式與DNA結合，調控、改變基因序列，影響了轉錄和翻譯仍需進一步證實。

(3)從量子層面分析分子間的相互作用在材料科學(尤其是納米材料)[10]、分子生物學領域發揮著重要的影響，有利于研發更精準的靶向治療藥物。人們對DNA與靶分子的相互作用研究取得了一定的理論與實際應用成果，但也存在著很多未能明了的問題：在研究方法上，因DNA序列、轉錄、翻譯的復雜性，DNA與藥物小分子相互作用的精細結構位點未能逐一明確，也沒有超精細的儀器能使DNA結構像病理組織一樣清晰地展現在顯微鏡上；且研究方法多種多樣，沒有一個全面系統的研究方法，都是零星研究，且方法不同分析的結果還會存在差別，需要進一步評估方法和結果。在生物反應中，藥物小分子經口-胃-腸-肝等較復雜的消化系統，即使是直接注射到血液中，血液成分也存在多種流動物質，故藥物小分子與DNA作用并不僅限于體外實驗這樣純凈，干擾因素較多，而且更深層次的結合規律還未知。但隨著量子化學、量子生物學、量子力學等微觀學科的發展，動物體內與藥物小分子相互作用的量子分析會更加清晰。