催產素的固相合成*

唐文力，李宜航

(常德職業技術學院，湖南 常德 415000)

催產素，又名縮宮素，是一種含有二硫鍵的環狀九肽激素，在人類和哺乳動物的垂體后葉中釋放，間接刺激子宮平滑肌收縮，模擬正常分娩的子宮收縮作用，導致子宮頸擴張，從而達到促進生產的功能，此外，催產素還可以刺激乳腺的平滑肌收縮，有助于乳汁自乳房排出，加快乳汁的分泌。所以催產素具有較高的藥用價值和應用市場。

圖1 催產素合成路線

目前催產素的制備方法主要是以哌啶為脫帽試劑的多肽固相合成法[1-2]，主要存在制備方法成本相對較高，并且不方便運輸和儲存的缺點。本研究采用以哌嗪作為脫帽試劑用Rink樹脂合成片段，哌嗪不是易制毒試劑，成本比經典合成法用的易制毒試劑哌啶要低，并且更方便運輸和儲存，此外，Rink樹脂合成片段還以方便自動化生產[3-8]；Rink樹脂可以回收重復利用；適合大規模工業化生產，沒有劇烈的化學反應；降低了生產成本。合成工藝流程如圖1所示。

1 儀器與試劑

Agilent technologies 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli--Q超純水系統，德國默克密理博公司；R-100型旋轉蒸發儀，瑞士Buchi公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；GL-150干式恒溫器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；XW-80A旋渦混合器，上海精科實業有限公司。

Rink Amide-AM Resin(Rink樹脂，替代度為0.48 mmol·g-1)，天津南開合成科技有限公司；所有氨基酸均采購自吉爾生化(上海)有限公司；O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、二異丙基乙胺(DIEA)，均采購自蘇州昊帆生物股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)、二乙胺、石油醚均為分析純。

2 方法與結果

2.1 試劑配制

2.1.1 Kaiser試劑

a液①40 g苯酚溶于10 mL無水乙醇；②65 mgKCN 溶于100 mL水，取2 mL用吡啶(pyridine)稀釋至100 mL。以10:100的比例混合①、②。

b液取2.5 g茚三酮溶于50 mL無水乙醇(需暗處保存)。

2.1.2 Fmoc-Ala-OH標準溶液

用電子天平精確稱取Fmoc-Ala-OH 標準品15 mg放入15 mL的離心管中。用移液槍精確移取10 mL 5%的哌嗪溶液，并將其加入裝有15 mg Fmoc-Ala-OH標準品的15 mL離心管中進行溶解，大約搖晃十 min后，配置成Fmoc-Ala-OH標準溶液。

2.1.3 脫保護溶液(5%哌嗪--DMF溶液)

5%哌嗪--DMF溶液：取25 g無水哌嗪溶于500 mL DMF中，配制成該溶液。

2.2 標準曲線的繪制

表1 不同濃度的Fmoc-Ala-OH溶液

取7支10 mL的離心管，并對其依次編號為1、2、3、4、5、6、7，取適量配置好的Fmoc-Ala-OH標準溶液與不同量的DMF溶液配置成濃度依次為0 μmol/L、0 μmol/L、19.28 μmol/L、38.56 μmol/L、57.84 μmol/L、77.12 μmol/L、96.40 μmol/L的混合溶液，放置待用，見表1。

用分光光度計測得各濃度混合液的吸光度，見圖2。

圖2 Fmoc-ALa-OH 溶液標準曲線

2.3 Gly-Rink 樹脂的制備

稱取1 g Rink Resin 于10 mL玻璃反應器中；加入約8 mL 20%哌嗪-DMF脫保護約20 min；抽去反應液，并用DMF洗滌2次、IPA洗滌3次、DMF洗滌4次。洗滌完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍黑色。

取10 mL塑料管稱取Fmoc-Gly-OH 約148 mg(依據為：樹脂質量*取代率*氨基酸分子量*倍數)，HBTU約189 mg，并用2 mL DMF溶解，接著加入DIEA約132 μL，將溶解后的溶液倒入玻璃反應器中，渦旋5 min左右。將渦旋好的反應器放置于搖床上搖置2 h，中途每0.5 h旋轉反應器一次。低壓抽去反應液，并用DMF洗滌2次，IPA洗滌3次，DMF洗滌4次，取少許樹脂滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈淺黃色。

量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應器中，反應20 min，然后抽去反應液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍黑色。

2.4 氨基酸與樹脂結合率的測定

從“2.3 Rink 樹脂和氨基酸相連”步驟中得到的“離心管(已標記)” 中，依次取出15 μL，10 μL溶液于10 mL離心管中，并用DMF溶液在離心管中定容到9 mL，然后用分光光度計依次測定所取溶液的吸光度，測得結果見表2。

表2 待測物吸光度

根據丙氨酸標準溶液C-Abs曲線，將A209nm (y)=帶入0.56=0.0066x-0.0019，可以計算氨基的濃度(x)為85.13 μmol/L。進一步可算出取代率為0.39 mol/g。

2.5 Fmoc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-樹脂的合成

得到Gly-樹脂后，向反應體系中添加第二氨基酸保護單體Fmoc-Leu-OH 339 mg、縮合劑HBTU 364 mg和堿DIEA264 μL，溶劑為DMF，反應時間為2 h，反應完成后，用DMF洗滌4遍，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈無色，既反應完全。得到Fmoc-Leu-Gly-樹脂后，量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應器中，反應20 min，抽去反應液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍黑色，既獲得Leu-Gly-樹脂。在獲得Leu-Gly-樹脂后，按照上述縮合反應方法，依次Leu-Gly-樹脂上連接氨基酸保護單體：Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH后得到：Fmoc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-樹脂。

2.6 二硫鍵的形成

取300 mg粗產物，加入560 mg碘單質和1.5 mL DMF溶液，混勻加入反應瓶中。依次反應2 h，4 h，6 h成環。其中

碘單質的量=取代率/[(目的產物肽鏈分子質量×取代率) +樹脂質量]

2.7 環肽的裂解

按照特定的氨基酸順序合成完所需多肽后，就要把目標多肽從樹脂上裂解下來，并進行進一步的分離純化。

取環化后的粗品于反應器中，分三次加入約2 mL三氟乙酸/三異丙基硅烷/水(TFA/TIS/H2O)=95/2.5/2.5(v/v)溶液，每次間隔20 min，收集濾液。向裝有濾液的離心管中倒入約40 mL冷凍的無水乙醚，出現白色絮狀沉淀，震蕩并在6000 r/min，20 ℃條件下離心5 min，倒去溶劑乙醚，絮狀物用氬氣吹干沉淀。沉淀真空干燥24小時，固體殘留物用離子水溶解，冷凍干燥得到白色絮狀固體672 mg，-20 ℃保存。經計算，產率為89.99%。

2.8 丙氨瑞林粗品的分析

對催產素進行HPLC分析，色譜柱為Krosmail100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A相(0.1 M NaH2PO4/H2O)，洗脫液B(MeCN-H2O=1:1)；梯度洗脫：0～30 min；70%B～40%A，流速為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm，其純度為97.68%，見圖3。

圖3 催產素色譜圖

2.9 樹脂回收

將樹脂用DMF洗滌三次，甲醇洗滌三次，抽去濾液，真空干燥。另配置二氯亞砜的DCM溶液，加入裝有樹脂的固相合成反應器中，反應2 h后，抽去反應液，DCM洗滌。

3 結 論

催產素作為臨床使用藥物，現階段對其藥理活性研究較多，其合成研究相對較少。目前，在現有技術中，多采用液相合成方式，操作繁瑣且副產物較多，此外，現有技術多采用哌啶作為脫帽試劑，該試劑為易制毒管制試劑，采購及運輸較為困難。本研究采用固相合成方式，反應簡單，純度為97.68%，收率為89.99%，降低了生產成本，減少了副產物的生產。

本研究利用多肽固相合成法成功合成了催產素，該方法操作簡單，Rink樹脂合成片段可以方便自動化生產且成本較低，純度高，反應條件溫和，適合大規模工業化生產。