基于DNA “Y”型結構的指數型核酸恒溫擴增策略檢測microRNA

鄭旭玲，殷 文，陳 俊，李 裕，戴 宗，鄒小勇

(1.中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275；2.中山大學 生物醫學工程學院，廣東 廣州 510006；3.南方醫科大學 藥學院，廣東 廣州 510515)

成熟的microRNA(miRNA)是一類長度約為19～23個堿基的非編碼RNA[1]。諸多證據表明，miRNA在包括細胞分化、早期發育、增殖、凋亡等眾多生命活動過程中均發揮重要的調控作用[2-3]，其表達水平與許多疾病密切相關，可作為疾病標志物和用于基因治療以及作為潛在的藥物靶點[4]。開發可靠、簡單、高效的miRNA檢測方法對于疾病的早期診斷具有重要意義。

近年來，基于核酸恒溫擴增策略的miRNA檢測方法獲得極大發展，如滾環擴增[5]、雜交鏈反應[6]、環介導等溫擴增技術[7]等線性擴增反應被成功應用于miRNA定量分析和細胞成像分析。相比之下，指數擴增反應(EXPAR)是一種在短時間可獲得高擴增效率(106～109)的核酸恒溫擴增方法，為miRNA的快速有效檢測帶來了便利[8]。EXPAR方法通常采用一個含兩段重復序列的對稱DNA模板，目標序列與模板的3′端互補雜交后，在聚合酶的作用下沿著模板延伸；延伸出的雙鏈DNA包含切口酶識別序列，被切口酶切割，并在DNA聚合酶的鏈置換作用下被釋放出來，進一步與另一條模板的3′端進行雜交和擴增，形成指數形式的擴增[9]。但這些方法存在如下問題：(1)擴增特異性和擴增效率仍有待提高。miRNA的準確分析有賴于擴增方法的效率和特異性。當前的擴增方法，指數擴增的效率很高，但更高階的擴增方法很難獲得；為提高擴增效率，往往需要復雜的設計和多擴增模板共同參與，且易產生非特異性擴增。(2)擴增反應的序列依賴性問題有待解決[10-11]。在大多數核酸擴增反應中，擴增模板序列不同，往往導致靶標與模板的結合力改變，引起擴增效率改變。這一缺陷限制了方法的通用性，不利于對多目標物的同時檢測。

針對上述問題，本文提出了一種基于“Y”型結構驅動的低序列依賴恒溫指數擴增方法(Y-EXPAR)。根據目標miRNA的識別序列設計兩個模板，兩部分互補的模板與目標miRNA形成Y型結構，在DNA聚合酶和Nt.BstNBI內切酶作用下，引發雙向恒溫指數擴增，實現miRNA的快速檢測分析。let-7b在細胞過程和人類疾病中扮演著重要角色，在肺癌、乳腺癌等幾種人類惡性腫瘤組織中呈低水平表達，且與其他let-7家族成員僅存在1～4個堿基差異[12-13]。本研究以let-7b為目標miRNA模型，探究了Y-EXPAR方法的檢測靈敏度、特異性和抗干擾性，以及在檢測不同CG含量的目標miRNA時的序列依賴性，并將本策略應用于A549細胞裂解液中let-7b表達量的檢測。相比于傳統線性和恒溫指數擴增方法，本策略能有效解決序列依賴性問題，且提高了擴增效率。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

DEPC處理水(Diethyl pyrocarbonate)、dNTPs、蛋白酶K和RNA酶抑制劑(上海生工生物工程公司)；寡聚核苷酸鏈的合成(序列如表1所示，上海生工生物工程公司)；Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內切酶、10×Nt.BstNBI buffer(25 mmol/L Tris-HCl,pH 7.9,50 mmol/L NaCl,5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L EDTA)、10×ThermoPol buffer(10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100)(北京紐英倫生物技術有限公司)；SYBR Green I(北京百泰克生物技術有限公司)；胎牛血清、鏈霉素、青霉素、胰蛋白酶和RPMI 1640培養基(美國Gibco)；人類肺癌細胞(A549，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

表1 本實驗中所用的核酸堿基序列*Table 1 Sequences of the oligonucleotides used in this work*

1.2 實驗方法

1.2.1Y-EXPAR方法的建立取離心管置于冰上，分別配制A和B溶液。A溶液包含目標miRNA、擴增模板T1和T2、dNTPs、RNA酶抑制劑和Nt.BstNBI buffer。B溶液包含ThermoPol buffer、Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內切酶和SYBR Green I。A和B溶液準備好后立即混合，加入適量DEPC處理水使溶液總體積為10 μL。體系中有0.5×Nt.BstNBI buffer，1×ThermoPol buffer，0.1 μmol/L T1，0.075 μmol/L T2，1 000 μmol/L dNTPs，0.06 U/μL Vent(exo-) DNA聚合酶，0.4 U/μL Nt.BstNBI 內切酶和 0.4 μg/mL SYBR Green I。將混合溶液放在CFX Connect Real-Time System 實時定量PCR儀(Bio-Rad，USA)，溫度設置為45 ℃，實時熒光強度的檢測時間間隔為30 s。

1.2.2EXPAR方法檢測miRNA 參考相關文獻[8]，本實驗基于EXPAR檢測miRNA的步驟如下：取離心管置于冰上，分別配制C和D溶液。C溶液包含目標miRNA、擴增模板T7、dNTPs、RNA酶抑制劑和Nt.BstNBI buffer。D溶液包含ThermoPol buffer、Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內切酶、SYBR Green I和DEPC處理水。C和D溶液準備好后立即混合，溶液總體積為10 μL。體系中有0.5×Nt.BstNBI buffer、1×ThermoPol buffer、0.1 μmol/L T7、250 μmol/L dNTPs、0.05 U/μL Vent(exo-) DNA聚合酶、0.4 U/μL Nt.BstNBI內切酶和0.4 μg/mL SYBR Green I。將混合溶液放在CFX Connect Real-Time System實時定量PCR儀(Bio-Rad，USA)，溫度設置為55 ℃，實時熒光強度的檢測時間間隔為30 s。

1.2.3細胞培養使用含有10%(體積比)胎牛血清(FBS)、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640 培養基，并在37 ℃含5% CO2的濕潤環境中培養A549細胞。

1.2.4細胞收集和裂解使用胰蛋白酶消化，以1 000 r/min離心5 min除去培養基收集A549細胞系。將細胞用RPMI-1640徹底清洗3次，加入RPMI-1640得到細胞濃度約1 000個/μL的重懸液，用RPMI-1640將懸浮的細胞溶液逐級稀釋至所需濃度。取1 μL細胞溶液放入置于冰上的0.2 mL PCR管，管中裝有0.9% NaCl溶液和40 U/mL RNase抑制劑，將細胞樣品迅速放入液氮中冷凍2 min后在98 ℃下熱處理3 min，再浸入液氮中，反復3次，使細胞膜破裂。為消化與miRNA結合的蛋白，將樣品與1 U蛋白酶K和10 U RNase抑制劑于53 ℃下孵育1 h，再于85 ℃下孵育20 min使蛋白酶解。處理后的細胞裂解液放在液氮中保存。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

本文以let-7b為目標miRNA模型，Y-EXPAR方法的原理如圖1所示。設計兩個DNA單鏈模板，模板T1的c序列和模板T2的c′互補，T1的b′與目標miRNA(let-7b)中的b互補，T2的a′與目標miRNA中的a互補。當目標miRNA存在時，T1、T2和目標miRNA三者的互補序列雜交形成“Y”型結構。在DNA聚合酶和dNTPs作用下進行雙向延伸，目標miRNA沿T1從5′端向3′端延伸形成DNA雙鏈，T1則沿T2延伸，兩個方向延伸形成的雙鏈DNA中均產生Nt.BstNBI內切酶的識別位點，引導內切酶進行剪切后，具有鏈置換活性的DNA聚合酶從切口的3′端繼續延伸，置換釋放與d互補的寡核苷酸d′。第一輪擴增，1個目標miRNA理論上產生2個d′序列；第二輪擴增，“Y”型結構重復“擴增-剪切-釋放”的過程，同時，2個d′序列與體系中剩余的模板T1和T2結合，在DNA聚合酶和Nt.BstNBI內切酶作用下理論上擴增產生2個d′，共產生4個d′；依次類推，第三輪擴增將釋放8個d′，第n輪擴增釋放2n個d′，實現d′序列的指數擴增。利用熒光染料SYBR Green I與雙鏈DNA的特異性結合，可定量體系中生成的雙鏈DNA，通過實時熒光變化檢測擴增過程積聚的產物。該Y-EXPAR方法操作簡便，可在45 ℃的恒溫下進行；相比傳統EXPAR方法，擴增效率更高，可快速對目標miRNA進行檢測；“Y”型結構的設計將目標miRNA的擴增轉化為以已知序列為觸發劑的擴增，擺脫目標序列不同對擴增反應的影響，有效避免序列依賴性，提高對不同miRNA檢測的適用性。方法有望在miRNA以及短鏈核酸分析方面提供高效快速的通用分析方法。

圖1 Y-EXPAR方法的原理圖Fig.1 Principle scheme of Y-EXPAR method

2.2 “Y”型結構對擴增速率的影響

配制相同濃度的let-7b溶液，以T1和T2為模板進行Y-EXPAR反應，使用T7為模板進行EXPAR反應。如圖2所示，EXPAR反應和Y-EXPAR反應的熒光強度均隨時間增加而指數升高。不同的是，相比EXPAR，Y-EXPAR能夠更快進入指數擴增階段，顯著縮短反應所需總時間。指數擴增反應的擴增速率可以用POI值(Point of inflection,POI)表示，即實時熒光曲線的最大斜率處(拐點)所對應的時間。

圖2 EXPAR和Y-EXPAR方法響應1 pmol/L let-7b的實時熒光曲線圖Fig.2 Real-time fluorescence curves of EXPAR and Y-EXPAR in response to 1 pmol/L let-7b,respectively

Y-EXPAR反應的POI值為7，EXPAR的POI值為18.5，表明Y-EXPAR具有更高的擴增效率。因為在EXPAR方法的第一輪擴增中，let-7b與單鏈模板T7結合后，DNA聚合酶以dNTPs為底物，使let-7b沿著模板T7延長形成雙鏈，內切酶剪切后產生等量寡核苷酸。相比之下，Y-EXPAR反應在第一輪擴增中，let-7b與兩個模板T1、T2共同形成“Y”型結構，從兩個方向同時進行擴增，經過內切酶的識別和切割，能夠釋放雙倍數量的寡核苷酸d′序列，引發更多的指數擴增反應，促使反應速率增高。

2.3 Y-EXPAR方法的可行性分析

miRNA同源家族中的成員序列相似度高[14]，因此，對miRNA的檢測需方法具有高特異性。為探究Y-EXPAR的特異性，本文使用let-7家族的不同成員進行測試。let-7家族成員的序列高度相似，let-7b與let-7c之間僅相差1個堿基，與let-7a、7d～7g、7i之間相差2～4個堿基。圖3A以T1和T2為模板，Y-EXPAR方法分別響應濃度為100 pmol/L的let-7b，以及let-7x(let-7a、7c～7g、7i)所獲得的實時熒光曲線。結果顯示，響應let-7b的實時熒光曲線強度增速遠快于響應let-7x的熒光曲線，表明let-7家族成員間雖然具有序列高度相似性，但Y-EXPAR方法仍能夠有效區分let-7b與其他let-7家族成員，顯示了較強的特異性。

POIx為let-7x實時熒光曲線的POI值，根據POI值與let-7b濃度的相關方程：POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L)，可得到POIx對應的let-7b濃度。將該相對濃度記為Alet-7x。通過系數(I%)評估本方法的特異性，計算公式如式(1)[15]。濃度相同時，相比let-7b，let-7x產生的信號非常微弱，其中，let-7i對應的I最大，但也僅為3.54×10-7%，表明Y-EXPAR方法具有優異的特異性，可區分目標miRNA和相似序列。

(1)

Y-EXPAR方法還展現了良好的抗干擾性。將let-7b與let-7a、7c～7g、7i分別混合配制7種混合樣品。混合體系中目標miRNA濃度為10 fmol/L，干擾miRNA濃度為其1 000倍，即10 pmol/L。利用Y-EXPAR方法對混合miRNA樣品進行檢測。如圖3B所示，10 fmol/L的let-7b樣品所對應的POIlet-7b約為8.00，含有干擾miRNA(let-7x)的混合樣品對應的POIlet-7x在6.67～9.00之間。與前述方法相同，根據POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L)，由POIlet-7b和POIlet-7x分別計算相對濃度Alet-7b和Alet-7x。通過計算系數(S%)評估let-7x對let-7b濃度檢測產生的干擾，計算公式如式(2)，系數越小特異性越強[15]。計算得S%為0.064%～7.47%。其中，let-7d和let-7g引起的干擾極小，分別為0.074%和0.064%，這是因為二者與let-7b相比均存在4個堿基錯配。總體而言，Y-EXPAR方法具有良好的抗干擾性。

(2)

2.4 Y-EXPAR方法序列依賴性研究

EXPAR方法在檢測不同miRNA時，擴增性能差別較大，其擴增效率在一定程度上依賴于模板序列[11]。Y-EXPAR中“Y”型結構的設計可降低目標miRNA序列變化對擴增效率的影響，改善序列依賴性問題。當目標miRNA不再是let-7b時，Y-EXPAR方法只需改變模板T1中的b′序列和模板T2中的a′序列，而T1中的c、d、e、d和T2中的c′、d、e、d無需變換。

CG的比例會影響雙鏈的穩定性。模板/觸發雙鏈中CG含量低，熔解溫度Tm值小，觸發劑與模板結合力弱；反之，CG含量高，熔解溫度Tm高，觸發劑與模板容易結合，但新形成的觸發劑難以解離[11]。使用CG含量不同的miRNA檢驗Y-EXPAR方法的序列依賴性。由let-7b的序列計算得知，let-7b的CG含量為45.5%。根據miRBase的數據[16]，本文對48 885種miRNA的CG含量進行統計，篩選出CG含量較低和較高的miRNAs，并選擇與人類相關的兩種miRNAs：miR-374a和miR-762(CG含量分別為22.7%和90.9%，堿基數目均為22個，與let-7b相同)進行考察。

作為對照，本文根據EXPER方法的原理為let-7b、miR-374a、miR-762分別設計模板T7、T8、T9，其擴增結果如圖4A所示。可以看到EXPER方法檢測濃度為10 fmol/L的miR-374a、let-7b、miR-762時，獲得的POI值差別明顯，分別為7.00、18.8和34.5，說明即使是擴增原理相同，對于不同GC含量的核酸，擴增效果差異依然很明顯。該差異會導致分析性能的明顯變化。在10 fmol/L～100 pmol/L濃度范圍內，let-7b的POI值隨濃度增加逐漸下降，而miR-374a和miR-762的POI值則無明顯變化。

相比之下，根據Y-EXPAR方法的測定原理，為miR-374a設計了模板T3和T4，為miR-762設計了模板T5和T6。如圖4B所示，隨著miRNAs濃度的增加，Y-EXPAR的擴增速率提高，let-7b、miR-374a和miR-762三種目標miRNA所對應的POI值均下降；在相同miRNA濃度下，let-7b、miR-374a和miR-762的POI值接近。實驗結果表明，Y-EXPAR方法檢測不同miRNA時，即使目標miRNA序列改變較大(GC值變化大)，模板仍能保持良好的擴增性能。DNA聚合酶將核苷酸整合到延長鏈中的速率與DNA模板的序列相關[11]。在Y-EXPAR方法中，目標miRNA與兩個模板形成“Y”型結構，擴增釋放d′，接下來的指數擴增反應由觸發劑d′引發。檢測不同目標miRNA時，d′的序列無需改變，避免了DNA聚合酶和不同DNA序列相互作用時的差異，降低了Y-EXPAR的序列依賴性。

2.5 Y-EXPAR反應條件的優化

2.5.1反應溫度Y-EXPAR方法中，反應溫度不僅能影響Nt.BstNBI內切酶和Vent(exo-) DNA聚合酶活性，還影響目標miRNA與模板雜交形成“Y”型結構，觸發劑與模板的結合，以及新合成的觸發劑從模板上的解離等。因此，需要對Y-EXPAR的反應溫度進行優化。由圖5A可知，當溫度為45 ℃時，實驗組和空白對照組的實時熒光曲線的POI差值(ΔPOI)最大。因此，將45 ℃作為Y-EXPAR的最佳反應溫度。

2.5.2Nt.BstNBI內切酶用量在Y-EXPAR方法中，Nt.BstNBI內切酶切割新生鏈，產生更多觸發劑進入擴增循環。本文探究了Nt.BstNBI內切酶用量對Y-EXPAR方法檢測性能的影響(圖5B)。當Nt.BstNBI內切酶為0.04 U/μL時，let-7b與空白對照間的熒光響應區分最為明顯，二者之間的ΔPOI最大，同時，Y-EXPAR方法保持較高反應效率；當Nt.BstNBI內切酶濃度增至0.05 U/μL時，Y-EXPAR方法的效率進一步提高，但let-7b與空白對照之間的熒光響應差異減小。因此，將0.04 U/μL作為Y-EXPAR反應中 Nt.BstNBI 內切酶的最佳酶量。

2.5.3Vent(exo-)DNA聚合酶用量根據實驗原理可知，DNA聚合酶在Y-EXPAR方法中能夠沿著模板延長互補鏈，并將切割后的DNA鏈置換下來。因此，DNA聚合酶用量將影響Y-EXPAR方法對miRNA的檢測能力。如圖5C可知，當Vent(exo-) DNA聚合酶濃度為0.04 U/μL時，Y-EXPAR的反應速度最慢；隨著DNA聚合酶濃度增至0.06 U/μL，Y-EXPAR的反應效率加快，空白對照的非特異性信號也增強；繼續增加Vent(exo-) DNA聚合酶濃度至0.08 U/μL和0.10 U/μL，Y-EXPAR的反應效率變化較小。根據ΔPOI和DNA聚合酶濃度的關系圖，當DNA聚合酶為0.06 U/μL時，ΔPOI最大，表明let-7b產生的熒光信號與空白對照的非特異性信號相差最大，Y-EXPAR方法能更好地區分let-7b和空白對照。因此，將0.06 U/μL作為Y-EXPAR反應中Vent(exo-) DNA聚合酶的最佳酶量。

2.6 Y-EXPAR分析能力研究

本文以T1和T2為模板，在反應溫度為45 ℃，Nt.BstNBI內切酶濃度為0.04 U/μL，Vent(exo-) DNA聚合酶濃度為0.06 U/μL的最佳實驗條件下，對不同濃度的let-7b進行Y-EXPAR擴增。圖6展示了各濃度let-7b產生的實時熒光曲線。隨let-7b濃度的增加，擴增速率加快。如圖6插圖所示，在1 amol/L～10 nmol/L濃度范圍，實時熒光曲線的POI值與let-7b濃度的對數值存在線性關系，線性方程為：POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L)(r2= 0.969)。本方法的檢出限為0.3 amol/L，相當于10 μL溶液中約有1.8拷貝的let-7b；且在保持良好檢測能力的同時，所需檢測時間僅為10 min，比常規EXPAR所需時間更短。Y-EXPAR方法能夠有效進行生物樣品中miRNA的檢測。

圖6 Y-EXPAR響應不同濃度let-7b的實時熒光曲線圖Fig.6 Real-time fluorescence curves of Y-EXPAR in response to different concentrations of let-7b let-7b concentration(1-10)：blank,1 amol/L,10 amol/L,1 fmol/L,10 fmol/L,100 fmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L;insert:plot of corresponding POI value and logarithm of let-7b concentration

2.7 細胞裂解液中let-7b的檢測分析

miRNA被認為是臨床上重要的生物標志物[17]。研究表明，let-7b能夠抑制幾種參與肺癌發展的蛋白質翻譯[13,18]，且肺癌患者的腫瘤組織和周圍組織中的let-7b表達顯著降低[13]。本文應用Y-EXPAR方法檢測了人類肺癌細胞A549中let-7b的表達量。在100個肺癌細胞的細胞裂解液中加入足量let-7b的反義核苷酸，以此作為陰性對照，運用Y-EXPAR方法進行檢測，計算實時熒光曲線最大斜率對應的反應時間，陰性對照的POI為13，緩沖溶液空白對照的POI為13.5，二者非常接近，表明Y-EXPAR方法可以在細胞裂解液的環境中進行目標miRNA的檢測分析。

運用Y-EXPAR方法對細胞裂解液進行檢測，如圖7所示，隨著細胞數目減少，細胞裂解液所對應的實時熒光曲線強度增長減慢，反應時間增加。且細胞數目在1～1 000范圍內時，細胞裂解液所對應實時熒光曲線的POI值與細胞數目的對數值存在線性關系，回歸方程為POI=10.2-1.30lg(Number of cells)。結果表明Y-EXPAR方法在檢測細胞中的miRNA方面具有較好效果，在臨床診斷中具有應用潛力。

圖7 Y-EXPAR響應不同數目A549細胞裂解液的實時熒光曲線圖Fig.7 Real-time fluorescence curves of Y-EXPAR in response to cell lysates from different numbers of A549numbers of A549(1-5):blank,1,10,100,1 000 cells

3 結 論

本文提出了一種基于DNA“Y”型結構的高擴增效率、低序列偏好的指數型核酸恒溫擴增方法——Y-EXPAR，并將其應用于miRNA的靈敏特異檢測。該方法延續了傳統EXPAR方法的主要優點，如反應可在恒溫下進行，操作簡便，同時在檢測let-7b和其它let-7家族時表現出良好的選擇特異性和抗干擾能力。此外，“Y”型結構還實現了雙向指數擴增，進一步提高擴增效率，縮短了分析時間。對于引發指數擴增反應的觸發劑而言，“Y”型結構能夠保證擴增反應的相對獨立性，有效克服擴增序列依賴性問題。本擴增方法為miRNA的快速檢測提供了新思路，在miRNA相關的疾病研究和臨床診斷方面具有良好應用前景。