常壓電離質譜在脂質精確結構解析中的研究進展

李佳潔，王 超，鄧潔薇*，欒天罡,2

(1.廣東工業大學 生物醫藥學院，廣東 廣州 510006；2.中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275)

脂質是生物體的重要活性化學物質，在細胞膜組成、能量儲存和信號傳遞等生物功能中發揮著重要作用[1-2]。2003年，美國國立衛生研究院所資助的“脂質代謝途徑研究計劃”項目提出了新的脂質分類系統，將脂質分為脂肪酰類(FA)、甘油脂類(GL)、甘油磷脂類(GP)、鞘脂類(SP)、固醇脂類(ST)、孕烯醇酮脂類(PR)、糖脂類(SL)和多聚酮類(PK) 8個大類[1]。每個脂質類別中又含有多種亞類，由于極性頭基、酰基鏈的長度或不飽和鍵數量及位置、立體構型等的多樣化，形成了成百上千種脂質及其異構體。截至2021年3月17日，除了區域異構體、氧化脂類和其他修飾形式外，脂質代謝途徑研究計劃(LIPID MAPS)結構數據庫已包含超過45 568種獨特的脂質結構。眾多研究表明，脂類化合物的結構和功能與細胞生理過程、糖尿病、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病、腫瘤等疾病進程相關[3-5]。細胞的生理活性和生化功能高度依賴于脂類化合物的化學復雜性和結構多樣性。因此，開展生物體的脂質分析和組學研究，對深入了解與脂質組成相關的生物學功能以及脂質在生命過程中的作用具有重要意義。

質譜(MS)技術由于靈敏度高、響應速度快、特異性好、無需標記、并且能給出豐富的分子結構信息等優點，正迅速地成為脂質分析和脂質組學研究的強有力工具[6-7]，且有關質譜技術在脂質組學研究方面的綜述文章已經有不少報道[2,8]。近年來，常壓電離質譜技術的發展，為常壓條件下的原位、實時、直接、快速、生物脂質分析和組學研究提供了重要手段[9]。例如，美國普渡大學Cooks課題組[10]利用解吸電噴霧電離質譜成像(DESI-MSI)技術分析了人腦腫瘤樣本的小分子代謝物和脂質化合物；美國喬治·華盛頓大學Vertes課題組[11]利用激光燒蝕電噴霧離子化質譜(LAESI-MS)技術研究了磷脂酰乙醇胺(PEs)和磷脂酰甘油(PGs)在大腸桿菌和枯草桿菌中的分布，以及它們與抗生素的相互作用。在國內，廣東工業大學欒天罡課題組[6]建立了基于表面修飾探針敞開式納升電噴霧質譜技術的脂質組學方法，實現了Daphnia屬生物大型溞和蚤狀溞的快速鑒別；中央民族大學再帕爾·阿不力孜課題組[12]提出了基于空氣動力輔助解吸電噴霧質譜(AFADESI-MS)的腫瘤代謝表征策略，通過對脂肪酸(FAs)、磷脂酰膽堿(PCs)、PEs等多種脂質的成像，深入探索了腫瘤代謝途徑。

1 PB光化學反應與常壓電離質譜聯用

PB反應因與質譜溶劑兼容性好、操作簡便、易于實現等優點，已成功地與多種常壓電離質譜如納升電噴霧質譜、液滴微連接表面采樣探針質譜、表面修飾探針納升電噴霧質譜等技術聯用。以下將詳細介紹PB光化學反應與常壓電離質譜聯用的分析方法。

1.1 PB反應與納升電噴霧質譜聯用

圖1 PB反應與質譜技術聯用[13]Fig.1 On-line coupling of PB reactions with MS for lipid analysis[13]A:experimental setup(實驗裝置圖);B:PB reaction mass spectrum of oleic acid and acetone induced by UV irradiation of-nanoESI;insert:PB reaction spectrum using D6-acetone(以D6-丙酮為試劑的FA∶18∶1的PB反應質譜圖),MS2 CID of the PB reaction products at m/z 339.3(C) and m/z 345.3(D)( 產物離子在m/z 339.3(C)和m/z 345.3(D)的二級質譜圖),E:fragmentation scheme of PB reaction product isomers(PB反應產物離子的裂解方式)

甘油三酯(TAGs)是一類非常重要的脂質化合物，作為能量儲存的形式存在于生物體中。TAGs的水溶性非常低，采用丙酮/水作為PB反應試劑時，其質譜分析往往難以獲得理想結果。華南農業大學杜冰團隊[24]采用二苯甲酮為PB反應試劑，將美藤果油(Sacha inchi oil)溶解于含有二苯甲酮的甲醇/氯仿(體積比9∶1)溶液中進行PB-nanoESI-MS分析，對美藤果油中的多不飽和甘油三酯(PUTAGs)進行了結構鑒定，并對13種C57-PUTAGs和23種C59-PUTAGs進行了鑒定。

Heiles團隊[26]以苯乙酮(AP)作為PB反應試劑，將不飽和磷脂酰膽堿(PC)溶于苯乙酮(含1%甲酸)溶液，經254 nm紫外光照射80 s后進行nanoESI-MS分析，可在質譜圖中觀察到增加了120 Da的光衍生化產物離子，且二級質譜圖中可見質量差為88 Da的診斷離子對，由此證實了苯乙酮作為PB反應試劑的可行性，且苯乙酮的反應產率達50%～80%。

1.2 PB反應與直接采樣電離質譜聯用

2018年，歐陽證團隊[28]提出了一種簡單方便的直接采樣電離質譜分析方法，將PB反應、直接采樣電離與小型質譜結合，在即時檢測方面具有非常良好的前景。該方法使用不銹鋼針對生物組織進行快速取樣，然后將載樣的不銹鋼針插入預先裝載有萃取脂質溶劑的玻璃納升電噴霧針中。在脂質萃取過程中，以丙酮/水為反應試劑，采用紫外光照引發PB反應。通過在不銹鋼針上施加高電壓，誘導脂質溶液產生納升電噴霧離子化，并采用小型質譜儀進行分析，實現了大鼠腦、肝、腎組織的快速脂質分析，以及大鼠正常和癌性乳腺組織中 FA(18∶1(Δ9)) 和 FA(18∶1(Δ11))的相對定量，并在小鼠癌證組織中觀察到FA(18∶1(Δ9))/FA(18∶1(Δ11))比率的顯著變化。

1.3 PB反應與液滴微連接表面采樣探針質譜聯用

1.4 PB反應與表面修飾探針納升電噴霧質譜聯用

圖2 SCP-PB-nanoESI-MS分析方法示意圖[31]Fig.2 Schematic diagram for development of a SCP-PB-nanoESI-MS method[31]

1.5 PB反應與多孔聚合物涂層轉移富集直接質譜聯用

2 環氧化與常壓電離質譜聯用

2.1 環氧化與低溫等離子體探針質譜聯用

2.2 環氧化與解吸電噴霧電離質譜聯用

2.3 環氧化與納升電噴霧質譜聯用

2019年，Yan等[38]首次報道了一種新穎可調的按需電化學環氧化反應與納升電噴霧質譜聯用鑒定不飽和脂質雙鍵的方法。他們發現在鹽酸和乙腈/水溶劑體系中，通過調節外加高壓可以控制不飽和脂質雙鍵的環氧化。施加2.5 kV電壓可以關閉脂質環氧化，而將電壓降至1.8 kV又可以實現脂質環氧化，且在不同電壓下還可按需生成單/多個環氧化合物。酸性條件下加入氯化物，可以在脂質雙鍵上原位形成次氯酸鹽并轉化為相應的環氧化物，整個反應過程在幾秒內即可完成。電環氧化產物隨后可通過CID裂解產生診斷離子來鑒定雙鍵位置。單樣品的快速開/關電環氧化、低樣品消耗、對含有多個雙鍵的復雜脂質的適用性以及不需要額外儀器等優點使得該技術在高通量脂質分析方面極具潛力。

3 臭氧誘導解離與常壓電離質譜聯用

4 紫外光解離法與常壓電離質譜聯用

紫外光解離法(UVPD)是另外一種非傳統的離子激發方法，主要利用光子激活和碎裂離子的能力。具有發色團的離子吸收了紫外光子能量后，從基態躍遷到電子激發態，進而在其激發態上發生鍵斷裂，從而產生豐富的碎片診斷離子，可用于化合物的結構或序列的表征[40]。

圖3 小鼠腦(A～D)、人腦(E～H)和甲狀腺癌轉移淋巴結組織切片(I～L)的H&E染色、m/z 798母離子成像圖、UVPD雙鍵診斷離子強度比成像圖，以及腦灰質和白質/癌組織和正常組織的UVPD譜圖[41]Fig.3 Optical images of the H&E stained,DESI-MS ion image of m/z 798,DESI-UVPD ratio image of the ratio of the summed intensities of the UVPD double-bond diagnostic ions,expanded region of UVPD mass spectra of the white and gray matter,and UVPD mass spectra of cancerous and normal parts of tissue from(A-D) mouse brain tissue section,(E-H) human brain tissue section,and(I-L) lymph node tissue section with thyroid cancer metastasis[41]

Heiles等[26]將PB-nanoESI-MS與UVPD相結合，提高了對雙鍵解離的選擇性，該UVPD也需對儀器改造引入紫外激光源和光路。實驗采用266 nm光源對不飽和脂質離子照射，未引起脂質離子的光解離。而采用苯乙酮作為PB反應試劑，先進行PB反應，再對產物離子進行紫外照射，則可發生紫外光解離，且提高了2.2倍PB反應選擇性。此外，還考察了各種脂質加合離子(Li、Na和K)的PB和PB-UVPD實驗。結果顯示，PB反應后加合離子抑制了氧雜環丁烷的CID碎裂，無法得到診斷離子碎片和雙鍵的信息，但經PB-UVPD反應后，氧雜環丁烷可以紫外光裂解，得到雙鍵特異性的離子片段，因此可以通過PB-UVPD來識別堿金屬加合物的雙鍵位置。

5 結論與展望