凝膠滲透色譜柱填料研究現狀

房志鵬，于 冰*，叢海林，劉虎威

(1.青島大學 化學化工學院，材料科學與工程學院，生物醫用材料與工程研究院，山東 青島 266071；2.武昌理工學院 生命科學學院，湖北 武漢 430223)

凝膠滲透色譜法(GPC)是19世紀60年代開發的一種液相色譜分離技術。其分離基礎是溶液中溶質分子的大小，溶質分子的洗脫量(即保留在色譜柱中的量)主要取決于物理參數，如溶質分子尺寸，不同填料的孔徑、孔隙率存在的差異，色譜柱體積以及流動相和固定相之間相互作用的差異，而與樣品無關。因此，凝膠滲透色譜具有對流動相的要求低、實驗條件相對穩定、重現性高、分析速度快、溶質回收率高等優點，使得該方法與其他方法相比具有更獨特的分離效果。由于其根據溶質分子的大小進行分離，已得到迅速發展并在許多領域獲得廣泛的應用。GPC法作為一種工具，在聚合物分子量測定以及分子量分布的精確測定方面具有廣闊且更有前途的應用前景。隨著液相色譜技術的發展，尤其是各種微孔高效凝膠填料的出現，GPC法越來越多地應用于石油、藥物、生物以及食品等領域，多用于物質組成分析以及對組分進行結構特性分析等。近年來，作為一種樣品預處理技術，GPC也被廣泛用于生物、環境、醫學、食品等樣品的預處理、分離和純化[1-3]。

柱填料是GPC技術的核心關鍵，其應用廣泛且對分離純化的結果起著決定作用。目前，基于凝膠的柱填料使用最為廣泛，例如聚丙烯酰胺凝膠、交聯葡聚糖凝膠、聚苯乙烯凝膠、瓊脂糖凝膠等。本文以上述填料為主，對凝膠滲透色譜柱填料的合成、性能和應用進行介紹。表1列出了此4種填料的主要制備方法及應用。

表1 常用填料的制備方法及其應用Table 1 Preparation and application of common fillers

1 聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺(PAM)凝膠是一種合成凝膠，由丙烯酰胺(AM)單體構成，并以亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑進行交聯反應。將其處理后形成顆粒。各種不同類型凝膠的制備可通過控制交聯劑占反應體系的比例來實現，交聯劑越多，孔越小。其適用于蛋白質[4-5]和多糖的純化。

聚丙烯酰胺微球又稱聚丙烯酰胺微粒或聚丙烯酰胺微凝膠，是指丙烯酰胺單體的均聚物或與其他單體共聚形成的高分子微球[6]。作為一種功能微球材料，其具有良好的吸水及保水性能，此外還具有良好的生物相容性，在眾多領域有著廣泛的應用。目前，聚丙烯酰胺微球的主要制備方法為均相法和非均相法。常見的均相法有反相乳液聚合法和反相微乳液聚合法，產物大多呈膠乳或微膠乳形態；非均相法有分散聚合法、沉淀聚合法、反相懸浮聚合法等，產物一般呈固體微粒狀態。

Yao等[7]采用聚合誘導相分離法，制備得到多孔磁性聚丙烯酰胺微球，微球表面由于具有多孔結構和磁性，對亞甲基藍(MB)具有較高的吸附效率。此外,微球對單獨存在的中性紅和龍膽紫或兩者混合溶液也具有很高的吸附能力。該微球最少可重復使用6個循環，與目前已有的吸附劑相比，具有更好的吸附能力和更高的效率，在陽離子染料吸附分離領域具有廣泛的應用前景。Zou等[8]通過丙烯酰胺和海藻酸鈉的乳液聚合，制備了一種新型雙網絡結構的聚丙烯酰胺/海藻酸鈉復合微球吸附劑，實現了對陽離子染料MB的吸附。該復合微球包含大量均勻分布的中孔，孔徑分布為0～200 nm。引入海藻酸鈉(SA)后，PAM的熱穩定性和結晶度雖略有下降，但MB的吸附容量顯著增加。

Wang等[9]合成了一種具有良好自發熒光的新型聚丙烯酰胺微球(fPAMMP)。通過原位聚合制備不同尺寸的低產率fPAMMP，利用反相微乳液聚合反應合成了小尺寸的高產率fPAMMP。制備的fPAMMP具有可見熒光(VF)和近紅外熒光(NIRF)的強而穩定的自發熒光，在各種嚴格條件下(如堿、酸和高溫)也具有很高的穩定性。所制備的fPAMMP具有高正電荷，可用于有效捕獲鏈霉親和素和DNA等各種生物分子，在聚合酶鏈反應(PCR)檢測中有良好的應用前景。

2 交聯葡聚糖凝膠

作為多糖大家族中的一員，葡聚糖(右旋糖酐)存在于某些微生物生長發育過程中排泄的黏液中，分子量較高，在輸血過程中可代替部分全血(稱為代血漿)，在臨床上的應用已有悠久歷史。軟性凝膠家族龐大且多樣，其中具有多孔性三度空間網狀結構的交聯葡聚糖凝膠微球具有豐富的孔道，能吸入大量的溶劑。凝膠體積可在水中溶脹數倍且不會溶解。孔徑范圍不同，其分離范圍也不同，在生物化學中被大量用于蛋白質[10-11]、核酸、酶和多糖類高分子物質的分離,是分離純化生物大分子不可或缺的一類介質[12]。

交聯葡聚糖凝膠微球的制備過程并不復雜，首先選取葡聚糖單體作為原料，后加入交聯劑與單體發生交聯反應，再經后處理得到微球。葡聚糖具有奇特的膠凝特性，單體通過交聯反應后得到的交聯葡聚糖凝膠微球不但具備優良的親水性，還具備良好的水不溶性以及吸水后溶脹的特點，在生物醫藥領域具有廣泛的利用價值。另外作為層析凝膠介質，其在分離純化方面也有著悠久的使用歷史，在其他領域也將有廣泛的應用前景。就現階段而言，交聯葡聚糖凝膠微球的制備方法分為化學、物理和相分離法，其中通過化學法生產的微球仍占市場主流。

交聯葡聚糖凝膠微球常用的化學制備法是乳化交聯法和反相乳液聚合法。這兩種方法是預先將葡聚糖單體溶于氫氧化鈉溶液中構成水相后，加入含有交聯劑的有機相中，經攪拌使兩相充分乳化，向溶液中加入交聯劑以形成微球。物理法是將藥物通過設備作用使其在氣相中進行微囊化的方法[13]。相分離法是通過改變混合溶液的溶解條件來降低聚合物在溶液中的溶解度，進而使微球從溶液中沉淀[14]。

交聯葡聚糖凝膠微球作為一種具有較好生物相容性的藥物載體材料，不僅可提高藥物的穩定性，對藥物起到緩釋作用[15-17]，還可作為環境敏感型分子的保護載體[18-19]和顯影劑使用[20]，未來有望用作傷口輔料[21]。本文著重介紹其在醫藥、凝膠層析、色譜分離、固相吸附及分析等領域的應用[22]。

曾家豫等[23]利用型號分別為G-25、G-50、G-75、G-100、G-125的Sephadex層析柱，對纖維素酶粗酶液進行分離。結果表明G-75具有良好的分離效果，其回收率可提高至41.6%，且與分離前相比，酶的比活力可提高4.9倍。張慧麗等[24]用Sephadex LH-20層析法對人參粗品進行兩次分離純化，再用Sephadex LH-20柱進一步純化得到人參皂苷Re，回收率為58.6%，純度為96.2%。該法簡化了樣品處理過程，克服了層析柱中原介質無法反復利用及再生繁瑣的弊端，具有省時、省力的優點[25]。包建民等[26]采用反向懸浮聚合制備的交聯葡聚糖凝膠微球具有優良的球形度、分散性、吸水溶脹和凝膠過濾分離性能，被用于對脂質體與藥物進行分析檢測。

由于交聯葡聚糖凝膠微球具有良好的生物相容性和可降解性，因此常被應用于靶向應用、栓塞治療、緩控釋應用等[27]。在控釋方面，藥物可包裹在葡聚糖內形成微小的球狀物，既能達成靶向的目標，也能達成緩釋的目標。Tomme等[28]將帶相反電荷的交聯葡聚糖凝膠微球混合分散，制得的凝膠主要應用于藥物活性蛋白基體，適用于傳遞藥物以及組織工程等領域。

3 聚苯乙烯凝膠

聚苯乙烯是以苯乙烯單體作為反應原料，選取不同的交聯劑通過一系列復雜的聚合反應得到的聚合物。苯乙烯單體分子具有一定的毒性，但聚合反應后得到的大分子聚苯乙烯無毒。相較于其它大分子，聚苯乙烯獲取方式及成本更低，機械性能更出色，具備良好的化學穩定性以及更好的生物相容性[29]，在吸附領域得到了非常廣泛的應用[30-32]。與其他凝膠相比，聚苯乙烯凝膠的網狀結構更大，因此用于分離分子量分布在1.6 k～40 000 k的生物大分子。聚苯乙烯還具有優良的機械強度，在手性藥物[33]、有機聚合物、抗腫瘤藥物[34-35]和油溶性天然物質的分離領域有著廣泛的應用。

聚苯乙烯呈中性，交聯聚苯乙烯-二乙烯基苯微球具有多孔結構，多被用于親脂性聚合物分子量的測量以及使用有機洗脫溶質進行分子量測量[36]。另外可用于分離結構相似的分子。

超交聯聚苯乙烯的交聯度和機械強度極高，與其他填料相比具有更高的耐壓性以及耐化學性，作為填料使用時可承受色譜柱中的高壓降。它可以使用任何pH值的水性洗脫液，這對硅膠填料來說是不可能實現的。因此，超交聯聚苯乙烯可用于反相、分配、尺寸排阻色譜等。雖然聚合物表面上沒有可測量的極性和帶電基團，然而其能夠對離子混合物進行有效分離。

孫磊麗等[37]以呈中性的多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)微球為填料，填充于S-X3玻璃柱作為GPC凈化柱，建立了一種檢測甘草中16種農殘的方法。沈習習等[38]選用苯乙烯樹脂為填料填充SX-3柱作為凈化柱，建立了一種檢測北京烤鴨鴨皮中16種多環芳烴的方法。Xu等[36]通過改性的種子聚合法合成聚苯乙烯多孔微球，發現合成的微球在碘萃取上具有良好性能。袁媛[39]以苯乙烯為單體，過硫酸鉀為引發劑，二乙烯基苯為交聯劑，采用可逆加成-斷裂鏈轉移(RAFT)活性聚合的無皂乳液聚合法制備了單分散的聚苯乙烯交聯微球。顧玥等[40]采用懸浮聚合法和超交聯兩步法制備了一種介孔改性聚苯乙烯微球，此微球在血液凈化領域具有良好的應用。Cong等[41]通過改進后的兩步種子溶脹法制備出粒徑約為10 μm的單分散交聯聚苯乙烯微球，發現改性后的微球對有機酸以及手性藥物有良好的分離效果。

聚苯乙烯微球(PST)具有理想的機械強度、可調節的粒徑和良好的化學穩定性，被普遍用作固定化載體。但使用微球進行固定的報道很少，Li等[42]制備了具有大孔和巨孔的PST,研究了孔徑對脂肪酶分布、相對活性、動力學行為、熱穩定性、儲存穩定性和可重復使用性的影響。根據激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)(如圖1)和掃描電鏡(SEM)，發現脂肪酶滲透到巨孔和大孔微球的中心，而介孔微球只在表面發生吸附現象。另外，固定化脂肪酶的比活性與巨孔/大孔/中孔PST的孔徑密切相關。在100次循環結束后仍具有很高的穩定性，且微球固化酶表現出較高的活性。因此，與其他微球相比，大孔PST作為工業上潛在的酶載體顯示出明顯優勢。

圖1 巨孔(A)、大孔(B)和中孔(C)PST微球固定化熒光胺脂肪酶的LSCM圖[42]Fig.1 LSCM images of fluorescamine-lipase immobilized on gigaporous(A),macroporous(B) and mesoporous(C) PST microspheres[42]scale bars represent 10 μm in each case; corresponding fluorescence distribution profiles along diameter are displayed below

4 瓊脂糖凝膠

瓊脂糖(Agarose)作為一種天然高分子材料，在生物相容性方面表現出色。瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖單體作為原料制備得到。瓊脂糖分為普通瓊脂糖和化學修飾的低熔點瓊脂糖。因瓊脂糖具備較大的孔徑，瓊脂糖凝膠常被用于大分子蛋白質[43]和DNA等物質的分離。瓊脂糖凝膠微球是呈多孔、親水和電中性的一種常用多糖微球，其多糖鏈具有幾個羥基可被活化并偶聯不同基團[44]。瓊脂糖微球的傳統制備方法主要有噴射法[45]、懸浮攪拌法[46]、微流控制法[47]和膜乳化法[48]等。

纖維素基吸附劑因生產成本低、易改性和生物相容性而受到越來越多的關注。然而，纖維素的固有缺陷，如弱機械性能和高結晶度等會嚴重影響分離效率。為克服這些問題，Zhao等[49]提出了一種預交聯結合瓊脂糖雜交的方法(如圖2)構建高強度、低結晶度的纖維素基微球。纖維素/瓊脂糖復合微球具有優異的機械穩定性，在蛋白質分離方面具有巨大潛力。為研究其在蛋白質分離中的應用潛力，用2-二乙基胺鹽酸鹽對預交聯纖維素/瓊脂糖復合微球(PRCA)、后交聯纖維素/瓊脂糖復合微球(POCA)進行了改性，并對其吸附容量、吸附速率和可回收性進行評價。

圖2 PRCA和POCA的制備[49]Fig.2 Preparation of PRCA and POCA[49]A：the crosslinking agent(epichlorohydrin) is preliminarily mixed with cellulose and agarose aqueous solution(pre-crosslinking),while the epichlorohydrin is added after emulsification in post-crosslinking process;B：the mechanism of cellulose and agarose chains crosslinked by ECH；C：the cellulose and agarose chains in PRCA are evenly crosslinked by covalent bonds while the internal cellulose and agarose chains of POCA is mainly crosslinked by hydrogen bonds

Zhao等[50]提出了一種改進的膜乳化技術用于制備大粒徑瓊脂糖微球，其粒徑約為90 μm，且粒徑分布窄。通過增加水分散相中瓊脂糖的濃度，可制備均勻性在2%～10%(質量分數)范圍內的微球。該研究中使用的膜乳化裝置放大后，可為制備工業應用的均勻尺寸瓊脂糖色譜填料提供一種有效的新工具。

瓊脂糖凝膠微球在很多領域均有廣泛應用，其中在分離分析領域應用尤為突出。邱廣亮等[51]選用瓊脂糖等天然高分子材料在磁性氧化鐵粒子表面進行包覆，制備得到磁性瓊脂糖微球。發現該磁性微球兼具兩種材料的優點，磁性使其能夠進行分離和磁性導向，此外還有良好的生物相容性、表面具備大量官能團、良好的分散性，具有極為廣闊的發展利用用途。尹霜霜等[52]采用反向懸浮再生法制備磁性瓊脂糖微球，經交聯活化后進行溴代醇化及其配基的偶聯，用于分離牛血清蛋白，在合適pH值下最大吸附容量為79 mg/g，循環使用5次后吸附容量降至最大吸附容量的76%，證明多次使用后仍具有較好的吸附性能。劉微等[53]利用反相懸浮原理制備瓊脂糖凝膠微球并進行交聯，以此為基質經過羧基化反應制得羧甲基瓊脂糖微球，發現以此微球作為填料在國產堿性蛋白酶的分離純化、除色、除味等方面有著較好的效果，可達到國外同類產品效果。劉姍等[54]建立了一種使用瓊脂糖微球抗體對原代乳鼠肺微血管內皮細胞進行篩選的新方法。

5 其 他

與常用的固定相相比，氧化鋯在化學穩定性和機械強度方面的性能更為出色，因此吸引了很多研究者的關注[55]。氧化鋯的pH值穩定性和對堿性物質優越的分離效果使其在生物化學、制藥產業等領域具有廣泛的應用前景，可用于氨基酸和多肽等生物分子。在蛋白質[56-57]、核酸、單克隆抗體分離[58-59]，對烷基取代的苯、芳烴、多環芳烴的分離也有報道[60]。氧化鋯還展示了各種極端條件下其在分離方面的獨特潛力[61-62]。若要實現高效率的分離，制備粒徑均勻且分布窄的氧化鋯微球最為關鍵。目前氧化鋯微球的制備方法比較單一，主要有聚合-誘導膠體凝聚法(PICA)和油乳化法(OEM)。相較于前者，后者操作更簡單，但后者制得的氧化鋯微球單分散性差且孔徑更小。目前我國多采用第一種方法制備氧化鋯微球。在國外，有許多關于通過PICA法制備氧化鋯微球的報道和專利。但國內關于制備條件對微球結構、粒徑和粒徑分布影響的報道相對較少。

作為一種硅膠填料，無孔硅膠的粒徑小于2 μm(亞2 μm)，合成方法主要有Stber微球法[63-64]、Unger法[65-66]、Barder法[67]、水熱法[68]、速率法[69]等。作為一種新型色譜柱填料，無孔硅膠具有很多良好的性質：其表面無孔且單分散性較好；具有較高的機械強度。相較于無孔硅膠填料，多孔硅膠的孔徑分布在30 nm左右，且受傳遞介質阻力的影響，多孔硅膠在有機分析中存在很大的局限性，有機物的最大分子質量不能超100 kDa。研究發現，制備更小粒徑的無孔硅膠填料有利于縮短分析時間、提高柱效，克服大粒徑多孔硅膠在傳質中存在的缺點，故近年來的研究熱點集中于小粒徑無孔硅膠上。

6 結 論

凝膠滲透色譜法作為色譜分離技術的一種，已廣泛應用于生命科學、環境科學、材料科學、醫藥衛生、化學化工等學科研究和工業生產中。伴隨著這些領域的強勁需求與發展，新的挑戰不斷出現。作為色譜技術的核心，色譜柱填料不僅是建立色譜方法的基礎，也是消耗品。近年來，色譜填料呈現兩大趨勢：一是亞2 μm小孔硅膠、核殼型硅膠填料；二是具有豐富選擇性的色譜填料，如手性色譜填料、親水作用色譜填料和混合模式色譜填料等。與上述常見填料相比，有機高分子基質色譜填料領域近年來也十分活躍，其主要可分為多糖型基質填料和聚合物型基質填料。與傳統填料相比，此填料具有更高的負載量和化學穩定性等優點，使其在生物大分子的分離分析領域應用極為廣泛，但現階段國內對此類填料的研究相對落后，還有很長的路需要探索。